化妆品中6-甲基香豆素的高效液相色谱法测定方法改进

化妆品中 6-甲基香豆素的高效液相色谱法测定方法改进

刘云怀

云南省丽江市食品药品检验所， 云南 丽江 674100

摘要 目的：通过不同的提取、分析方法，改进了化妆品中6-甲基香豆素的高效液相色谱法测定方法。样品用甲醇提取，以：乙腈：0.02mol/L磷酸二氢钠缓冲液（磷酸调pH=3.5）为流动相，C18柱分离，二极管阵列检测器检测。 结果：线性范围为：0.1μg·ml^-1～10.0 μg·ml^-1，6-甲基香豆素最低检出限为0.03μg·g-1，回收率为98.3%～100.7。结论：该方法较《化妆品安全技术规范》（2015年版）化妆品中6-甲基香豆素的测定法第一法分离效果更好，柱效更佳，检出限更低。为化妆品中6-甲基香豆素的定量检测方法提供了一个新思路。

关键词：化妆品；6-甲基香豆素；高效液相色谱法测定

6-甲基香豆素是一种合成香料, 主要用作有机合成中间体和香料。是我国 GB 2760规定为允许使用的食用香料，主要用以配制椰子、香草和焦糖等型香精。常用作定香剂配制化妆品, 同时也是一种光感性皮炎致敏物, 当添加有6-甲基香豆素的化妆品涂于皮肤表面后, 经光照会引起皮肤炎症[1]，且对人类的肝脏有危害。6-甲基香豆素在我国卫生部颁布的《化妆品卫生规范 (2007版) 》中, 规定为化妆品组分中的限用物质[2]。《化妆品安全技术规范》（2015年版）规定6-甲基香豆素为禁用物质[3]。

《化妆品安全技术规范》（2015年版）中，化妆品中6-甲基香豆素的定量检测方法为高效液相色谱法和气相色谱法，必要时，采用气相色谱-质谱法确证阳性检测结果。本文用高效液相色谱法对化妆品中6-甲基香豆素进行了测定，并将该方法进行了适当改进。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1.1.1 安捷伦1260型高效液相色谱仪（二极管阵列检测器）；

1.1.2 色谱柱 OmniGene LLC生厂的HPLC Column Hubble C18柱，规格5µm 150×4.6mm。

1.1.3 德国塞多利斯BT224S电子分析天平、梅特勒MS205DU电子分析天平；

1.1.4 TGL-10C台式高速离心机。

1.2 对照品及试药

1.2.1 6-甲基香豆素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：520003-201301，按100.0%计）；

1.2.2 乙腈（色谱纯，美国塞默飞世尔科技（中国）有限公司）；

1.2.3 磷酸二氢钠（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）；

1.2.4 磷酸（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）。

2 高效液相色谱测定

2.1 色谱条件与系统适用性试验

2.1.1 色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

2.1.2 检测波长：275nm；

2.1.3 柱温：35℃：

2.1.4 流动相：

时间/min 乙腈V% 0.02mol/L磷酸二氢钠缓冲液（磷酸调pH=3.5） V%

0 50 50

11 50 50

12 92 8

30 92 8

31 50 50

40 50 50

2.1.5 进样量：10μl；

2.1.6 流速：1.0 ml·min^-1。

2.2 标准储备液及系列标准工作液的制备

2.2.1 标准储备液的制备：精密称取6-甲基香豆素对照品（食品药品检定研究院，批号520003-201301，含量为100.0%）：10.24mg，置10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得：1024.0 μg·ml^-1的标准储备溶液Ⅰ。

2.2.2 系列标准工作液的制备：分别精密量取标准储备溶液Ⅰ，加甲醇制成：0.1024 μg·ml^-1、0.2048μg·ml^-1、0.5120 μg·ml^-1、1.0240 μg·ml^-1、3.0720μg·ml^-1、5.1200 μg·ml^-1、8.1920 μg·ml^-1、10.2400 μg·ml^-1的一系列标准工作液。

2.3 供试品溶液的制备：称取样品1g（精确到0.001g）于10mL容量瓶中，加入5mL甲醇，涡旋振兴荡使样品与提取溶剂充分混匀，超声提取30min，冷却至室温后，用甲醇稀释至刻度，混匀后转移至10mL刻度离心管中，以5000r/min离心5min。上清液经0.45µm过滤，滤液备用。

3 结果与讨论

3.1 提取方法的优化

3.1.1 提取溶剂的优化：因为6-甲基香豆素易溶于乙醇、甲醇、乙醚和苯，难溶于水，分别选取丙酮、乙醇、甲醇作为提取溶剂。对不同的化妆品进行测定得出，丙酮提取杂质较多，乙醇提取率没有甲醇好，故采用甲醇作为提取溶剂。

3.1.2 超声时间选择：选用了超声10min、20min、30min、40in、50min、60min进行提取，经检测发现，超声10min、20min提取率明显低于超声30min，而超声40in、50min、60min的提取率与超声30min时相差无几，故选择超声30min，而非原标准方法中的20min。

3.2高效液相色谱条件的优化

3.2.1 检测波长的选择：以二极管阵列检测器进行全波长扫描，发现6-甲基香豆素对照品在275nm处有最大吸收，因此采用274nm作为检测波长。

3.2.2 流动相的优化：采用的不同比例的甲醇-0.02mol/L磷酸二氢钠缓冲液（磷酸调pH=3.5）梯度及不同梯度的乙腈-0.02mol/L磷酸二氢钠缓冲液（磷酸调pH=3.5）对不同的化妆品样品中6-甲基香豆素进行测定，发现所选方法用时短，分离效果更好，柱效更佳，检出限更低。

甲醇-0.02mol/L磷酸二氢钠缓冲液（磷酸调pH=3.5） 乙腈-0.02mol/L磷酸二氢钠缓冲液（磷酸调pH=3.5）

3.3两种方法的比较

2.3.1线性关系、检出限及定量限、稳定性考察

两种方法线性关系、检出限及定量限、稳定性均符合方法学验证要求，无明显差异。

2.3.3两种方法的回收率和精密度

分别取1#供试品1.0g各6份，两种方法分别加入10.2400 μg·ml^-1标准工作液1.0ml、3.0ml，用与样品相同的分析条件进行加标回收实验，结果见下表。

表1 回收率及精密度（n=6）

样品含量 加标量 原方法平均测得 原方法平均回收率 新方法平均测得 原方法平均回收率

（μg·ml^-1） （μg·ml^-1） （%） （μg·ml^-1） （%）

未检出 1.024（n=3） 0.923 90.1 1.031 100.7

未检出 3.072（n=3） 2.973 96.8 3.017 98.2

2.3.4实际样品测定

在与测定标准溶液样品相同色谱条件下对11批次处理好的化妆品供试品进行检测，并用质谱对高效液相色谱测定的结果进行验证，均未检出6-甲基香豆素。

4结论

经改进后，该方法较《化妆品安全技术规范》（2015年版）化妆品中6-甲基香豆素的测定法第一法分离效果更好，柱效更佳，检出限更低。可为化妆品中6-甲基香豆素的定量检测方法提供一个新思路。

参考文献：

[1]田富饶，王旭强，孙文闪.化妆品中6-甲基香豆素的高效液相色谱-紫外检测器法测定[J]香料香精化妆品，2012（1）：30-32.

[2]中华人民共和国卫生部.化妆品卫生规范[S]2007：239-241.

[3]中国国家标准化管理委员会.化妆品安全技术规范[S]2015：217-224.