(云南省药物研究所,云南白药集团创新研发中心,云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室,云南 昆明, 650111;)
摘要 目的:建立盐酸小檗碱有关物质检查的分析方法,并对中国药典分析方法中存在的问题进行讨论。方法:采用反向高效液相色谱法测定盐酸小檗碱有关物质。色谱柱为Waters XTerra C18柱(4.6×250 mm,5 µm);流动相为0.05mol/L磷酸二氢钾(用磷酸调节pH值至2.8)和乙腈(78:22, V/V);检测波长为345 nm;柱温为25 ℃;进样量为10 µl;流速为1.0 ml/min。结果:在该色谱条件下,盐酸小檗碱主峰与7个杂质峰的分离度均大于1.5,2个已知杂质(盐酸药根碱和盐酸巴马汀)的定量限分别为2.5 ng和4.9 ng,检测限分别为0.1 ng和0.2 ng;平均回收率分别为100.0%和102.7%;与盐酸小檗碱的相对校正因子分别为1.06和1.05;在0.5~20 μg/ml浓度范围内,线性关系良好(r>0.999)。重复性、中间精密度的RSD值均小于2.0%且耐用性符合要求。结论:该方法专属性强,准确度高,适用于盐酸小檗碱的有关物质检测。
关键词 盐酸小檗碱;有关物质;杂质来源;高效液相色谱法
盐酸小檗碱最早是从中药黄连中提取得到的一种生物碱,又名盐酸黄连素,在小檗科、毛莨科和防己科等植物中广泛存在[1-3]。其对痢疾杆菌、肺炎球菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、伤寒杆菌、白喉杆菌、霍乱孤菌、脑膜炎奈瑟菌和志贺菌属等具有较强抑制作用,对阿米巴原虫也有一定作用,临床主要用于痢疾杆菌、大肠杆菌等导致的肠道感染[4-5]。
盐酸小檗碱质量标准最早收录于1963年版中国药典,其有关物质检测方法为TLC法,直到中国药典2010年版,才将有关物质检测方法由TLC法变更为HPLC法。变更后的有关物质测定方法采用0.01mol/L磷酸二氢铵溶液(用磷酸调节pH值至2.8)-乙腈(75:25)为流动相,并规定已知杂质盐酸药根碱和盐酸巴马汀含量不超过1.0%,其它未知杂质不超过2.0%[6-7]。经研究发现,中国药典中盐酸小檗碱有关物质检查方法受样品来源、流动相比例、色谱柱品牌型号、样品水分含量等因素影响,会导致测定结果偏离真实值,不利于产品质量的有效控制。本文在中国药典有关物质测定方法的基础上,对色谱条件进行优化,细化实验操作,结果表明优化后的分析方法更加准确、可靠,能有效解决中国药典方法中存在的问题。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司),Agilent 1260二极管阵列检测器,Waters XTerra C18色谱柱(4.6×250 mm,5 µm),LC Open lab色谱数据工作站。
1.2 试药
盐酸小檗碱(原料药,提取品,四川协力制药有限公司提供);盐酸小檗碱(原料药,合成品,东北制药集团股份有限公司提供);盐酸小檗碱对照品、盐酸药根碱对照品和盐酸巴马汀对照品(中国食品药品检定研究院提供);乙腈(色谱纯,默克公司提供);磷酸二氢铵(分析纯,国药集团股份有限公司提供)。
2 分析方法
对照品溶液配制:精密称取盐酸小檗碱对照品、盐酸巴马汀对照品和盐酸药根碱对照品各适量,加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含盐酸小檗碱20 μg、盐酸巴马汀10 μg和盐酸药根碱10 μg的混合溶液。
供试品溶液配制:取本品约25 mg,置25 ml容量瓶中,加流动相适量,超声10 min使主成分溶解,加流动相稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液作为供试品溶液。
色谱条件:色谱柱:Waters XTerra C18柱(4.6×250 mm,5 µm);流动相:0.05 mol/L磷酸二氢钾(用磷酸调节pH值至2.8)和乙腈(78:22);检测波长:345 nm;进样量:10 µl;柱温:25 ℃。
3 分析方法验证
3.1 系统适用性试验
分别取空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液,照“2”项下色谱条件试验。结果:在该色谱条件下,盐酸药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱依次出峰,供试品溶液中检出7个杂质峰,各杂质与主成分(盐酸小檗碱)的分离度以及各杂质间的分离度均大于1.5,表明该色谱条件专属性良好。
3.2 破坏试验
精密称取盐酸小檗碱约25 mg,置25ml容量瓶中,分别置酸性(加1 mol/L盐酸溶液2 ml,室温放置24 h)、碱性(加1 mol/L氢氧化钠溶液2 ml,室温放置24 h)、氧化(加30%双氧水溶液2 ml,室温放置24 h)和高温(105 ℃电热恒温干燥箱,8h)条件下进行强制降解,降解结束后加流动相适量,超声溶解,适当中和溶液至中性并稀释至刻度,滤过,取滤液照“2”项下色谱条件试验。结果:在上述破坏试验条件下,主成分与各已知杂质、降解杂质均能有效分离,表明拟定的色谱条件对主成分和杂质的测定无影响。
3.3 线性关系考察
精密称取盐酸小檗碱对照品、盐酸巴马汀对照品和盐酸药根碱对照品适量,加流动相溶解并稀释制成每1ml约含100 μg的混合溶液,作为线性标准储备液。取线性标准储备液逐级稀释,配制系列浓度的线性标准液,分别进样10 μl,照“2”项下色谱条件试验。结果:在0.5 μg/ml~20 μg/ml浓度范围内,盐酸小檗碱回归方程为A=41.2116C-0.0012,相关系数R2=0.9999。盐酸药根碱回归方程为A=43.5717C+0.4750,相关系数R2=1.0000。盐酸巴马汀回归方程为A=43.0732C+0.5215,相关系数R2=0.9999。盐酸药根碱、盐酸巴马汀与盐酸小檗碱的相对校正因子分别为1.06和1.05。
3.4 检测限与定量限
进样10 µl的条件下,盐酸小檗碱的定量限为0.49 µg/ml,检测限为0.20 µg/ml;盐酸巴马汀的定量限为0.49 μg/ml,检测限为0.2 μg/ml,盐酸药根碱的定量限为0.25 μg/ml,检测限为0.10 μg/ml。定量限浓度均低于供试品溶液浓度的0.05%,表明本方法能满足杂质检测灵敏度要求。
3.5 回收率
向盐酸小檗碱供试品溶液中加入高、中、低3个浓度的盐酸药根碱和盐酸巴马汀溶液,计算9份供试品溶液中盐酸药根碱和盐酸巴马汀的回收率。结果:高、中和低浓度9份供试品溶液中,盐酸药根碱的回收率为99.99%,RSD值为0.98%;盐酸巴马汀的回收率为102.74%,RSD值为0.80%。结果见表1和表1。
表1 盐酸药根碱回收率试验结果
样品名称 | 供试品加入量(mg) | 盐酸药根碱加入量(μg) | 盐酸药根碱实测量(μg) | 盐酸药根碱回收率(%) | 平均回收率(%) | RSD(%) |
供试品溶液 | 25.23 | 0 | 66.60 | / | 99.99 | 0.98 |
回收率1 | 25.19 | 81.36 | 133.89 | 99.97 | ||
回收率2 | 25.04 | 81.36 | 133.18 | 99.72 | ||
回收率3 | 25.25 | 81.36 | 133.47 | 99.19 | ||
回收率4 | 25.13 | 101.76 | 169.24 | 101.26 | ||
回收率5 | 25.17 | 101.76 | 169.11 | 101.00 | ||
回收率6 | 25.25 | 101.76 | 166.90 | 98.79 | ||
回收率7 | 25.20 | 122.11 | 202.11 | 99.77 | ||
回收率8 | 25.16 | 122.11 | 202.34 | 100.08 | ||
回收率9 | 25.16 | 122.11 | 202.78 | 100.44 |
表2 盐酸巴马汀回收率试验结果
样品名称 | 供试品加入量(mg) | 盐酸巴马汀加入量(μg) | 盐酸巴马汀实测量(μg) | 盐酸巴马汀回收率(%) | 平均回收率(%) | RSD(%) |
供试品溶液 | 25.23 | 0 | 2.23 | / | 102.74 | 0.80 |
回收率1 | 25.19 | 78.67 | 80.32 | 102.10 | ||
回收率2 | 25.04 | 78.67 | 80.62 | 102.47 | ||
回收率3 | 25.25 | 78.67 | 80.14 | 101.87 | ||
回收率4 | 25.13 | 98.34 | 102.11 | 103.84 | ||
回收率5 | 25.17 | 98.34 | 100.81 | 102.51 | ||
回收率6 | 25.25 | 98.34 | 101.95 | 103.67 | ||
回收率7 | 25.20 | 118.01 | 120.37 | 102.00 | ||
回收率8 | 25.16 | 118.01 | 120.76 | 102.33 | ||
回收率9 | 25.16 | 118.01 | 121.82 | 103.23 |
3.6 重复性
平行制备6份供试品溶液,照“2”项下色谱条件试验。盐酸药根碱测定结果的RSD值为1.21%,盐酸巴马汀测定结果的RSD值为1.49%,总杂测定结果的RSD值为1.49%。本法重复性良好。
3.6 中间精密度
取本品,由不同的试验人员、不同时间和不同的高效液相色谱仪按重复性项下试验,计算每份供试品溶液中盐酸药根碱、盐酸巴马汀和总杂的含量。结果:盐酸药根碱RSD值为1.29%,盐酸巴马汀RSD值为1.79%,总杂RSD值为1.05%。本法中间精密度良好。
3.7 溶液稳定性
取供试品溶液,室温密封放置,分别于0、2.5、5、7.5、10和30 h取样测定。结果表明30 h内,供试品杂质个数、含量均未见明显变化,溶液稳定性良好。
3.8 耐用性
取供试品溶液,分别测定其在标准色谱条件及色谱条件发生微小改变时,供试品溶液中各杂质含量。结果表明在流速、柱温和流动相pH值等色谱条件发生微小改变时,测定同一份供试品溶液中杂质含量及杂质数目均未见明显变化,表明本法对色谱条件的耐用性良好。结果详见表3。
表3 耐用性试验结果
变动因素 | 色谱条件 | 盐酸药根碱含量(%) | 盐酸巴马汀含量(%) | 杂质总量(%) | 杂质数 (个) |
标准条件 | 流速:1.0 ml/min 柱温:25 ℃ pH2.8 | 0.68 | 0.02 | 1.60 | 7 |
流速变化 | 流速:0.8 ml/min | 0.68 | 0.02 | 1.62 | 7 |
流速:1.2 ml/min | 0.68 | 0.02 | 1.62 | 7 | |
柱温变化 | 柱温:20 ℃ | 0.68 | 0.03 | 1.61 | 7 |
柱温:30 ℃ | 0.69 | 0.02 | 1.60 | 7 | |
流动相pH | pH2.6 | 0.68 | 0.02 | 1.60 | 7 |
pH3.0 | 0.68 | 0.02 | 1.60 | 7 | |
RSD(%) | / | 0.49 | 0.00 | 0.88 | 0.00 |
4 结果
4.1 色谱条件优化
中国药典中采用0.01 mol/L磷酸二氢铵溶液(用磷酸调节pH值至2.8)-乙腈(75:25)为流动相,经研究发现,在该流动相比例条件下,杂质与主峰未达到有效分离。本研究通过色谱条件优化,能有效改变各杂质与主成分峰间的分离度.
4.2 色谱柱对测定结果的影响
中国药典中仅规定了采用碳十八烷基硅烷键合硅胶柱进行盐酸小檗碱的有关物质检测,并未对色谱柱的规格、型号、厂家和品牌等参数进行规定和说明。经研究发现,不同厂家、不同品牌、不同规格和不同型号的色谱柱在测定同一份样品时,其测定结果存在显著差异,结果详见表4。故需对测定盐酸小檗碱有关物质所用的色谱柱进行规格、型号、品牌、厂家等参数的细化规定。
表4 不同厂家色谱柱对测定结果的影响
色谱柱厂家 | 色谱柱品牌 | 色谱柱型号 | 主峰保留时间(min) | 杂质个数 | 测定结果 |
Waters | XTerra C18 | 4.6×250mm, 5µm | 22.15 | 7 | 各杂质峰形良好,杂质间分离度良好,主峰与相邻杂质间分离度良好。 |
Waters | symmetry C18 | 4.6×250mm, 5µm | 14.39 | 6 | 杂质峰形差,主峰拖尾,与主峰相邻杂质被主峰包裹,未达基线分离。 |
Agilent | Eclipse Plus C18 | 4.6×250mm, 5µm | 27.69 | 6 | 各杂质峰形差,与主峰相邻杂质被主峰包裹,未达基线分离。 |
Agilent | Agilent SB-Aq C18 | 4.6×250mm, 5µm | 35.58 | 5 | 各杂质峰形良好,相邻杂质互相包裹,未达基线分离。 |
4.3 样品来源对测定结果的影响
中国药典中规定了盐酸小檗碱有提取品和合成品两种来源途径,但无论是提取来源还是合成来源的盐酸小檗碱,均执行同样的有关物质测定方法和标准。经杂质研究发现,提取品和合成品在杂质种类、含量和来源等方面存在显著不同。提取来源的盐酸小檗碱中的杂质主要为植物体内的生物碱,其中包括了中国药典中规定的盐酸药根碱和盐酸巴马汀,而合成来源的盐酸小檗碱中的杂质主要由化学合成过程中引入,杂质种类繁杂,但含量较低。合成来源的盐酸小檗碱中不含有盐酸药根碱和盐酸巴马汀,而中国药典中规定盐酸药根碱和盐酸巴马汀含量不超过1.0%,对于合成来源的盐酸小檗碱来说,该杂质限度的制定已失去了质量控制的意义。故建议在进行有关物质检测时,需根据原料药来源的不同,针对性的制定提取品和合成品的有关物质检测项目及限度。
4.4 水分对测定结果的影响
中国药典中规定盐酸小檗碱为二水合物,即1个盐酸小檗碱分子中含有2个结晶水,其理论含水量为8.8%。而标准中规定盐酸小檗碱的水分含量不超过12%即视为合格,标准限度与理论含水量存在较大差异。经研究发现,不同厂家生产的盐酸小檗碱水分含量有较大差异,其水分含量在8%~12%之间。中国药典中在进行盐酸小檗碱有关物质检测时,并未考虑其水分对测定结果的影响,使得有关物质测定结果偏低,结果详见表5。因中国食品药品检定研究院提供的盐酸药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱对照品均以无水物计,故建议扣除原料药中的水分含量后再计算有关物质含量。
表5 水分对有关物质测定结果的影响
水分含量(%) | 有关物质(%) | ||
盐酸药根碱 | 盐酸巴马汀 | 总杂 | |
0.0 | 0.23 | 0.06 | 0.78 |
8.8 | 0.21 | 0.05 | 0.71 |
12.0 | 0.20 | 0.05 | 0.69 |
参考文献
[1] 韩宁娟, 方欢乐, 牛睿, 等. 盐酸小檗碱提取方法研究进展[J]. 生物化工, 2018, 4(2): 135-137
[2] 李嘉诚, 吴岚, 蔡同凯, 等. 黄柏化学成分及药理作用研究进展[J]. 药学实践杂志. 2018, 36 (5): 389-391+398.
[3] 李峰. 黄连的化学成分及质量标准的研究[D]. 四川大学, 2007.
[4] 张茜, 朴香淑. 小檗碱抑菌作用研究进展[J]. 中国畜牧杂志. 2010, 46(3): 58-61.