实时荧光定量 PCR熔解曲线法在结核性包裹性胸膜炎术中标本检测的应用价值

实时荧光定量 PCR熔解曲线法在结核性包裹性胸膜炎术中标本检测的应用价值

杨成

黑龙江省传染病防治院 哈尔滨市 150500

摘要：目的：探讨实时荧光定量PCR熔解曲线法检测，在结核性包裹性胸膜炎手术患者中的应用，术中取干酪物送检，行实时荧光定量PCR熔解曲线法耐药检测和结核菌快培960培养加药敏，对比两者的符合率。方法：选取我院2018年1月至2019年12月，我院收治的130例结核性包裹性胸膜炎手术患者，行胸腔镜纤维板剥脱术，术中取干酪物送检实时荧光定量PCR熔解曲线法耐药检测，结核菌快培960培养加药敏，以及病理检测，术后病理回报符合结核性胸膜炎病理改变。结果：结核性包裹性胸膜炎患者行胸腔镜纤维板剥脱术，术中取干酪物送检实时荧光定量PCR溶解曲线法检测，阳性患者81例占62%耐药患者14例占10%，结核菌快培960培养结核菌加药敏培养阳性62例占48%，耐药18例占14%。实时荧光定量PCR熔解曲线法检测与结核菌快培960培养结核菌加药敏培养符合率达96% 。结论：结核性包裹性胸膜炎患者行胸腔镜纤维板剥脱术，术中取干酪物送检实时荧光定量PCR溶解曲线法检测耐药，根据检测结果指导术后用药，具有重要意义。

关键词：结核性；包裹性胸膜炎；胸腔镜纤维板剥脱术；耐药检测

结核性包裹性胸膜炎患者，是一种由结核分枝杆菌引起的呼吸系统疾病，以发热、胸闷伴咳嗽无痰为主要临床表现^[1]。结核性胸膜炎患者治疗不及时，出现胸膜纤维化在临床上比较常见，表现为胸膜增厚，形成结核性包裹性胸膜炎，导致肺膨胀不全引起胸廓塌陷，需要早期手术治疗^[2]。结核病因耐多药和广泛耐药结核病患者增多与流行，早期耐药结核性胸膜炎患者，由于通过胸水检测耐药比较有限，所以耐药结核性胸膜炎治疗效果欠佳，形成包裹^[3]。本研究通过130例结核性包裹性胸膜炎病人，术前胸水检测实时荧光定量PCR溶解曲线法均为阴性，全部患者行胸腔镜纤维板剥脱术，术中取包裹性胸膜炎腔内干酪物送检实时荧光定量PCR溶解曲线法检测耐药，和结核菌快培960结核菌培养加药敏。病理回报结核性胸膜炎。对比结核菌快培960结核菌培养加药敏结果与实时荧光定量PCR溶解曲线法的符合率。

一、研究资料

1. 患者来源

选择2018年1月至2019年12月黑龙江省传染病防治院收治的130例结核性包裹性胸膜炎患者，130例患者中男性88例；女性42例；年龄15 -69岁，平均（35.6±4.3）岁。

2. 诊断标准

1. 结核性包裹性胸膜炎诊断标准：1.临床表现：典型结核中毒症状发热、畏寒、盗汗、乏力、食欲不振、胸闷气短伴咳嗽无痰等^[4]。2.胸水常规回报渗出液,腺苷脱氨酶的含量>45U/L^[5]。3.结核感染外周血血T淋巴细胞斑点实验阳性。4.外周血浆细胞分泌特异性结核分枝杆菌抗体检测阳性^[6]。5.胸部CT回报胸腔内形成包裹性积液，胸膜增厚。6.经抗结核治疗症状明显缓解。具备上述诊断标准中的3项或3项以上即可确诊。

2. 入组标准：选取结核性胸膜炎患者中，胸腔积液为包裹性，胸膜肥厚＞5mm者，胸腔积液送检实时荧光定量PCR溶解曲线法回报阴性，胸部CT或胸部超声提示胸腔积液形成包裹^[7]。

二、研究方法

（一）标本收集：所有结核性包裹性胸膜炎患者，术前行胸部超声对包裹积液进行体表定位，行胸腔镜纤维板剥脱术，术中取腋中线第6肋间切口长约5厘米，进胸腔后游离增厚的纤维板至返折处，打开包裹性腔隙清除积液，取返折处干酪样组织送检实时荧光定量PCR溶解曲线法检测耐药和快培960结核菌培养加药敏，彻底清除腔内干酪样坏死组织与积液，切除增厚的脏壁层纤维板，膨肺满意后留置引流管关胸术毕，送检病理。

（二）标本的检测：标本送检实时荧光PCR熔解曲线法，主要检测四种主要的抗结核药物一线药和二线药的耐药检测，采用自动化核酸提取，标本检测和软件自动判读结果，全过程仅需3-4小时，检测基因突变位点，利福平，rpob7-533之间任意突变；异烟肼，ahpc启动子区（-44—-30以及-15—3位点）znhA94密码子，inhA启动子区（-17—-8位点）以及k9tG315密码子；乙胺丁醇，embB306.368.378.380 460.497.密码子突变；氟喹诺酮gyrA88-94内任意突变^[8]。荧光PCR熔解曲线法的原理是在一定环境下，DNA双链在其长度和序列一定时，熔点（Tm值）也一定，当发生错配时，Tm值下降，下降的幅度与发生错配的碱基数目、类型和位置有关^[10]。在PCR体系中加入两端分别标记有荧光基团与淬灭基团的探针，在PCR过程中扩增出与探针序列互补的单链寡核苷酸序列，在扩增完成后增加熔解曲线分析过程，同时实时监测荧光值的变化，通过计算荧光值与温度的负导数，获得探针与该序列杂交产物的熔解曲线，并得出熔点Tm值，从而推得该序列突变信息

^[9]。送检结核菌960快速培养：标本送检经处理后，接种于MGIT培养管中进行培养，培养出结核菌后，检测对于链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇、利福喷丁、左氧氟沙星、莫西沙星、阿米卡星、卷曲霉素、丙硫异烟胺、力克肺疾、对氨基水杨酸钠、克拉霉素、利福布汀、卡那霉素和氯法齐明的药物敏感实验。

三、结果

结核性包裹性胸膜炎患者130例患者，实时荧光PCR熔解曲线法检测结果，结核菌960快速培养加药物敏感实验检测结果，实时荧光PCR熔解曲线法检测结果与结核菌960快速培养加药物敏感实验检测结果的符合率：

1. 实时荧光PCR熔解曲线法81例阳性62%，耐药14例10%，存在同时耐异烟肼和利福平。

2. 送检结核菌960快速培养加药物敏感实验阳性93例71%，耐药18例14%，存在同时耐异烟肼和利福平。

（三）实时荧光PCR熔解曲线法检测结果与结核菌960快速培养加药物敏感实验检测结果的符合率96%。

四、讨论

结核性包裹性胸膜炎患者130例，术前检测均无结核菌耐药，术中取干酪物送检实时荧光PCR熔解曲线法81例阳性62%，耐药14例10%。术中干酪物送检结核菌960快速培养加药物敏感实验培养阳性93例71%，耐药18例14%。实时荧光PCR熔解曲线法检测结果与结核菌960快速培养加药物敏感实验检测结果的符合率96%。

结核性胸膜炎患者存在耐药可能，经系统抗结核治疗效果欠佳，胸腔内包裹形成结核性包裹性胸膜炎，需行手术治疗。现术中取干酪病变送检实时荧光PCR熔解曲线法，可快速检测耐药情况，比术前胸水检测阳性率明显升高，并且与结核菌960快速培养加药物敏感实验符合度高达96%。结核性包裹性胸膜炎患者行胸腔镜纤维板剥脱术，术中取干酪物送检实时荧光PCR熔解曲线法，可快速检测耐药情况，根据检测结果指导临床术后抗结核化疗方案的组成，以达到良好的术后治疗效果。

结核性包裹性胸膜炎患者，术前胸水检测耐药阳性率较低，术中取干酪样坏死组织送检实时荧光PCR熔解曲线法阳性率较高，而且时间较短（四小时），并与8周后的结核菌960快速培养加药物敏感实验符合度较高可达96%，可全面应用于临床，对结核性包裹性胸膜炎患者早期明确耐药情况，根据耐药结果指定抗结核化疗方案，以达到患者最大受益。

参考文献：

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