蜂胶总黄酮提取工艺优化与含量测定研究

蜂胶总黄酮提取工艺优化与含量测定研究

逯鑫名

哈药集团制药六厂 哈尔滨 150000

【摘 要】目的：研究蜂胶总黄酮的最优提取工艺，测定总黄酮的具体含量。方法：采取正交试验法及单因素法，不断优化提取工艺，选择芦丁作为本次研究的对照品，测量其实际含量。结果:在乙醇体积分数为95%且料液比为1：9时，将温度控制为50℃，持续提取48h的情况下，可以达到最佳提取效果，提取到的黄酮总量为10.82%，含有五种化合物。结论：该提取工艺比较简单快捷，并且符合蜂胶总黄酮的提取要求，可以将其作为提取方法或者综合性指标。

【关键词】蜂胶；总黄酮；提取工艺；含量

天然物蜂蜜是一种胶状固体物质，由密封从植物上采集，混入分泌物及蜂蜡后得到的物质，具有一定的芳香气味。蜂胶拥有多种生物活性作用，包括抗氧化、提高免疫力、降血脂等，最关键的功效成分有两种，一种为黄酮类化合物，另一种为酚酸类化合物。蜂胶内总黄酮含量与场地有着较大的关系，为此要选择适合的研究材料。

1研究材料及方法

1.1研究材料、试剂及仪器

材料：本次研究蜂胶取自某县城养蜂场，选择秋季采集蜂胶。

试剂：芦丁、乙醇、乙酸乙酯、甲醇、醋酸钾、丙酮等（均为国产分析纯）。

仪器：λ-17型紫外-可见光谱仪美国PE公司；QP2010气相色谱-质谱联用仪日本岛津公司；RE-52AA旋转蒸发仪上海圣科仪器设备有限公司；SHZ-III型循环水真空泵杭州雷琪实验器材有限公司；冷柜、电子天平。

1.2研究方法

1.2.1制作标准曲线

精确称取在120℃减压干燥至质量恒定的芦丁标准品20.00mg，置100mL容量瓶中，并向其中加入100mL乙醇溶液，定容，即得0.2mg/mL芦丁标准液。准确吸取芦丁标准液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL分别置于25mL容量瓶中，各加乙醇至6mL，加质量分数5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置10min；加质量分数10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置10min；加质量分数5%氢氧化钠溶液10mL，摇匀，加乙醇至刻度，定容，放置15min；以辅料溶液作为空白，在波长502.1nm处均有最大吸光度。以质量浓度对吸光度作图，得芦丁标准曲线，线性回归得芦丁质量浓度（x）和吸光度（y）的回归方程为y=11.8223x－0.0032（R2=0.998）。

1.2.2提取和测定总黄酮类

首先，要合理处理蜂胶原料，将准备好的原料放入冰箱，冷冻处理5h，该步骤主要是为了让蜂胶逐渐变硬变脆，如果不经过冷冻处理，蜂胶会具有较强的粘性，不方便后续处理。在冷冻结束以后，可以对蜂胶进行烽燧处理，采用40目筛，留下备用。

接下来，完成原材料的处理以后，就可以对总黄酮类进行提取及含量测定，先将刚才处理后的原料加入不同类型的提取液，要注意提取液体积要控制在蜂胶原料的5倍左右，温度保持在30℃左右，持续浸渍48h，重复2次上述步骤，将所有浸液冷却处理，等到温度降至5℃以后，可以将蜂胶内的蜡过滤出来，采用乙醇溶液定容，得到100ml溶液，再取1ml定容到6ml，还要额外设置对照组，采用乙醇溶液作为对照溶液，按照相同操作绘制出泸定标准曲线，计算出黄酮总量。

1.2.3GC-MS分析

首先，要对蜂胶样品进行合理处理，加入5倍体积的提取液，温度控制在30℃，浸渍时间在48h，重复上述步骤，等待浸液冷却到5℃以内，才能得到浓度为50mg/mL的分析溶液。接下来，要对其进行GC-MS分析。气相色谱条件：RTX-5MS石英毛细管色谱柱；升温程序：60℃保持1min，以10℃/min升至300℃，保持5min；载气流速1.0mL/min，压力3.4kPa，进样量1μL；分流比30:1。质谱条件：电子轰击离子源；电子能量70eV；传输线温度250℃；离子源温度200℃；质量扫描范围m/z30～500。

2研究结果及分析

2.1不同溶液提取液中总黄酮含量测定

本次研究选择多种提取液，包括乙醇、甲醇、乙醚、丙酮、乙酸乙酯、水等，不同提取液的提取效果有所不同，主要分为以下几种情况：一是乙醚、乙酸乙酯及丙酮，这类溶液极性相对较差，可以提取出大量的黄酮类物质，提出含量分别为11.2%、7.4%及10.7%。二是乙醇，该提取液的极性稍强，提取量相对较少一些，具体为9.36%。三是水溶液，极性相对更强，无法提取出黄酮类物质，含量仅有0.9%。根据上述结果，综合考虑到费用、安全性等方面，最终选定乙醇溶液。

2.2单因素试验

2.2.1乙醇体积分数研究

精确称取5份蜂胶，分别取体积分数60%、70%、80%、95%乙醇和无水乙醇各10mL，在30℃下浸渍48h，分离出浸提液，再重复加入2次，合并浸提液冷却至5℃以下过滤，按上述方法测定总黄酮含量。经过一系列的试验表明，在乙醇体积分数提升时，总黄酮含量也在提升，在体积分数在95%左右时，提取量达到最高。有机溶剂本身存在一个相似相容的原理，这也适用于乙醇溶液，总黄酮溶出量由乙醇极性决定，在两者极性相似的情况下，才能得到最多的总黄酮类物质，为此确定95%的体积分数，可以达到最多的总黄酮类物质。

2.2.2提取时间研究

精确称取5份蜂胶，在料液比1:5、乙醇体积分数95%、30℃条件下浸提，时间分别为8、16、24、48、72h。在48h内，随着提取时间的延长总黄酮含量增加显著，48h以后变化不大，这说明蜂胶中的黄酮类化合物绝大部分在48h内可被提取出来。因此提取时间选择48h为宜。

2.2.3温度指标研究

精确称取4份蜂胶，在乙醇体积分数95%、料液比1:5条件下20、30、50、70℃恒温浸提48h。按按1.2.2.2节方法测定总黄酮含量。在温度不断上升以后，总黄酮含量也在持续增加，在50℃左右达到最高，一旦超出该温度范围，就会出现含量下降的情况，说明温度控制在50℃才能达到最大含量。究其根本原因，随着温度身高，黄酮溶解度也在持续上升，但是温度超出50℃以后，则会对化合物结构产生破坏，为此需要将温度控制在合理的范围内，同时保证黄酮类物质提取量，为此温度控制在50℃。

2.2.4液料比研究

精确称取4份（2.00g）蜂胶，在乙醇体积分数95%、温度30℃条件下浸提48h，研究液料比在3:1、5:1、7:1、9:1，对总黄酮提取效果的影响。经过一系列试验研究发现，在料液比逐渐增加以后，总黄酮含量持续增加，但是随着料液比上升，会耗费的大量的溶剂，一方面会造成资源浪费，另一方面会增加试验成本，影响后续工艺，经过试验测定后决定，将料液比控制在7：1。

根据单因素试验的结果及有关资料，确定以乙醇体积分数、提取时间、料液比、提取温度4因素进行正交试验设计，对新疆产蜂胶中的总黄酮提取工艺进行优化。影响总黄酮含量的因素顺序为乙醇体积分数＞提取温度＞提取时间＞料液比，K值分析可知，蜂胶总黄酮的最佳提取工艺为乙醇体积分数 95 %、料液 比 1:9、提取时间 72h、提取温度 50℃。，在此条件下，测得总黄酮含量为10.82%。

3结语

蜂胶拥有复杂的化学成分，现在已经发现的成分就有300余种，而蜂胶内发挥功效的核心成本有两种，一种为黄酮类化合物，也是本次研究的核心，另一种为酚类化合物。本文围绕总黄酮提取工艺展开研究，选择多种提取溶液，经过一系列的实验测定，确定其最佳提取工艺，也就是温度为50℃、提取时间为72h、料液比为1:9、乙醇体积分数为95%的情况下，可以实现对总黄酮类物质的高效提取，希望可以为今后的黄酮类物质提取提供帮助。

参考文献

1. 霍丽斯,刘嘉亮,陈颖芯.高效液相色谱法测定蜂胶中的六种黄酮[J].农产品加工,2019（11）:54-55.

2. 梁凤珍.蜂胶中总黄酮的提取与紫外可见分光光度计的测定[J].中国化工贸易,2018,010（029）:94-97.

3. 张文文,王凯,孙丽萍,等.蜂胶提取工艺研究进展[J].中国蜂业,2018（7）:51-53.