基于蛋白组学研究不同时期玉米胚中药效成分

基于蛋白组学研究不同时期玉米胚中药效成分

林宇辉，佟瑶，董俊峰，李发梅，宁德利 *

齐齐哈尔医学院药学院，黑龙江　齐齐哈尔　 161006

[基金项目]黑龙江省大学生创新创业训练计划项目(No.201711230037)

[通讯作者]*宁德利，博士，讲师，从事生物化学及蛋白质组学研究，Tel: 0452-2663512

E-mail: ndl99@126.com。

摘要：目的：以玉米胚为材料，找出药效蛋白含量最佳及营养价值最高的发育时期。方法：从4个不同时期的玉米胚中提取总蛋白，通过2-ED分析差异蛋白。结果：在变化显著差异的1100±12蛋白点中，找到6个蛋白为候选有意义蛋白。结论：寡肽酶A(Oligopeptidase A, Spot1)在25DAP中表达最高，表明活性肽相关蛋白含量最高，而谷胱甘肽s-转移酶III (Glutathione S-transferase III，Spot 5, 6)随着时间增加而含量升高，在30 DAP是累积最高峰。

关键词：玉米胚；药效成分；2-ED

玉米属禾本科玉秫黍族谷类植物。玉米胚蛋白经过酶解能够得到具有生物活性的肽产品，具有多种生理功能，包括抗疲劳、抗氧化、加快代谢水平、降血压、降血脂、保肝、抑制肿瘤细胞增殖等。

玉米胚中富含不饱和脂肪酸，具有降低胆囊中胆固醇的作用，长期食用能够防止血管粥样硬化症，并对高血压和心脏病都有显著的疗效。

材料

1.1 玉米胚　B73玉米株来自黑龙江省农科院齐齐哈尔分院，取授粉后15、20、25和30天后(DAP)的胚进行实验。

1.2　试剂　Acrylamide、Bis-Acrylamide、Urea、Thio Urea、β-Mercaptoethanol、TEMED、EDTA-Na、CHAPS、PMSF、DTT、Sodium thiosulfate均购自美国Sigma公司。

1.3 仪器　等电聚焦电泳系统 (Ettan　IPGPhor3，美国GE公司)、垂直电泳系统 (Ettan　DALTsix，美国GE公司)、MCV-13161FT 型超净台(日本Sanyo公司)，5417R型离心机(德国Eppendorf公司)。

2 方法

2.1　蛋白提取及定量　

取4个时期玉米胚置于液氮中充分研磨，分别用蛋白提取液和蛋白裂解液进行处理。处理后样品经4℃，10,000g，10分钟离心，收集上清液。蛋白经2D-Clean up纯化后用2D-Quant定量。

2.2双向凝胶电泳　双向电泳参考文献^[1]并作修改，等电点聚焦使用IPGphor系统（Amersham Pharmacia Biotech Inc.），线性 pH 4-7的24cm预制胶条（Amersham Pharmacia Biotech Inc.）及包含Urea 8 M、2% CHAPS、DTT 20 mM、0.5%(v/v) IPG buffer的缓冲液。

SDS-PAGE的进行使用的是12.5%聚丙烯酰胺凝胶。凝胶扫描是使用PowerLook 2100XL扫描仪（UMAX, Xinzhu, China)，而分析是用Imagemaster 2D编辑软件（version 4.01;GE Healthcare, USA）。对每个样品进行三次重复电泳。

2.3　质谱分析　

将酶解肽段样品离心,取1μl上清与1μl含10mg/ml基质CHCA的50%乙腈/0.1%TFA后，在靶板上点样，UltraflexTM MALDI-TOF-MS/MS质谱仪检测。加速电压是20kV,反射式正离子检测。所获得的PMF用MASCOT搜索引擎在NCBInr数据库中查询,容忍度为士0.1并可容忍一个胰蛋白酶位点漏切。

3 结果

3.1　2-DE分析

在对玉米胚形态学观察和变化的基础上，对四个发育阶段样品的蛋白质组进行了分析。用pH值4-7的等电聚焦，并获得了更大分辨率的二维凝胶。三次重复，所有凝胶的可重复蛋白点的数量均为1100±12。由于高分辨率的结果，在20DAP获得的玉米胚蛋白质组的2D主凝胶中检测到1108个可重复的蛋白点(图1)。在两个样品间相对丰度上，蛋白质斑点的变化有统计学意义(P<0.05)。因此，使用LC-MS/MS进行鉴定。经过严格筛选，得到108个蛋白点呈显著变化。通过对不同的胶图比较发现，在所有4个时期中检测到56个(52%)蛋白，39个蛋白上调，17个蛋白下调，8个(7%)蛋白在单个时期表达。

3.2　药效成分蛋白分析 经过LC-MS/MS和MASCOT鉴定，6个药效成分相关候选蛋白如表1显示，寡肽酶A(Oligopeptidase A)，淀粉合成酶1(Granule-bound starch synthase 1)，半胱氨酸合成酶1(L-cysteine biosynthesis 1)，谷胱甘肽转移酶(Glutathiones-transferase)和谷胱甘肽s-转移酶III (Glutathione S-transferase III)。6个蛋白点在不同的时期表现出不同的表达丰度，如图2所示。

图1 20天玉米胚的2-ED图

表1 6个表达差异的药效成分相关的候选蛋白

图2　6个蛋白点在4个时期的表达变化

4　讨论

玉米胚蛋白经过酶解能够得到具有生物活性的肽产物，活性肽一般指的是由2-7个氨基酸组成的小肽类物质。而抗疲劳肽主要指的是2-10个氨基酸形成的直链寡肽(oligopetide)或小肽分子，分子量一般不超过1KDa；也有的是大于10个氨基酸的多肽(polypeptide)^[2]。结果显示寡肽酶A(Oligopeptidase A, Spot1)在25DAP中表达最高，表明活性肽相关蛋白含量最高。

此外，玉米胚中还原型谷胱甘肽具有抗氧化的作用。它在临床医药领域上用于保护肝脏、治疗肿瘤等^[3]。本研究中谷胱甘肽s-转移酶III (Glutathione S-transferase III，Spot 5, 6)随着时间增加而含量升高，表明在玉米胚发育后期，随着胚的成熟，谷胱甘肽也达到了最高值，30 DAP是累积最高峰。

然而，Spot 4与Spot 5, 6的表达趋势不同，它在整个时期呈现下调表达，可能与谷胱甘肽s-转移酶III的生物功能不同，有待于以后工作的深入研究。

本文实验结果鉴定出玉米胚药效蛋白含量最佳及营养价值最高的发育时期，筛选出评价玉米胚药效的特异性蛋白靶点。

参考文献：

[1] Tong A, Wu L, Lin Q, et al. Proteomic analysis of cellular protein alterations using a hepatitis B virus-producing cellular model. Proteomics, 2008,8, 2012-2023

[2] Julie E, Hardwiek, Charles E. Enzymatic hydrolysis of corn Gluten meal [J]．Afric Food Chem,1989,(37):1188~1192

[3] 钱勇．还原型谷胱甘肽治疗酒精性脂肪肝临床疗效观察[J]．健康必读杂志，2011(1):103