利用 FPLC分析转基因小型猪血浆脂蛋白

利用 FPLC分析转基因小型猪血浆脂蛋白

姜薇 魏静元

辽宁省分析科学研究院，沈阳 100015

摘要：为了分析ApoCIII转基因小型猪中脂蛋白组成的变化，本文应用快速蛋白液相色谱（FPLC）法对转基因小型猪脂蛋白组成的变化进行表征，分别检测转基因猪的肝脏和小肠的ApoCIII，转基因小型猪的VLDL颗粒明显高于非转基因小型猪。结果表明，转基因小型猪过表达了人的ApoCIII。

关键词：ApoCIII；转基因小型猪；VLDL

Analysis of transgenic miniature pig plasma lipoprotein by FPLC system

JING Wei WEI Jing-yuan

(Liaoning Province Academy of Analytic Sciences, Shenyang 110015)

ABSTRACT:To analysis the changes in lipoprotein composition of ApoCIII transgenic miniature pig, Fast protein liquid chromatography( FPLC ) were performed to characterize the changes of lipoprotein composition in the transgenic miniature pig. As a result, hApoCIII were detected in the transgenic miniature pig’s liver and small intestine,and the transgenic miniature pig’s VLDL particles is significantly higher than non transgenic miniature pig. The results showed that VLDL particles significantly increased because of over expression of hApoC in transgenic miniature pig.

Key words: apolipoprotein CIII；transgenic miniature pig；VLDL

载脂蛋白CⅢ(Apolipoprotein CⅢ，ApoCⅢ)是一种低分子水溶性蛋白质，79个氨基酸残基，单链多肽，分子量为8.7-8.8kD，主要分布在血浆高密度脂蛋白（high density lipoprotein ，HDL）、极低密度脂蛋白（very low-density lipoprotein ，VLDL）和乳糜微粒（chylomicron;，CM）中。ApoCⅢ 抑制脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）^{[ 1，2，3，4]}， 但没有证据显示他们之间存在直接结合^[5] 。我们应用核移植^［6］等技术，获得了人ApoCⅢ（hApoCⅢ）转基因克隆小型猪^[7]。hApoCⅢ转基因克隆猪由于过表达了人的ApoCⅢ蛋白，其脂蛋白构成发生了变化，由此也带来了一些生理功能方面的改变，本文对此进行了分析和探讨。

FPLC全称为快速蛋白液相色谱(Fast protein liquid chroma tog raphy), 其原理与高效液相色谱理论类似，利用不同的层析柱(疏水、离子交换、凝胶、亲和、反相等),将所需的蛋白质^[8，9]、多肽^[10]及多核苷酸[11]或要去除的杂蛋白从样品中分离出来。

FPLC不但保持了HPLC 的快速、高分辨率等特性, 而且还具有柱容量大、回收效率高及不易使生物大分子失活等特性；因此在近年来在分离蛋白质、多肽及寡核苷酸等方面得到了广泛应用。

1 材料

1.1 实验动物

hApoCⅢ转基因克隆猪。

1.2仪器和材料

快速蛋白液相色谱仪（AKTA explore10），Superdex 200TM 10 /30 GL型凝胶过滤柱，Milli-Q纯水机，0.22 μm Millipore滤膜。离心机（CF16RXII,日立）。

乙腈为色谱纯，其他为分析纯。

流动相：乙腈-水体积比1︰1， 流速为1.0 mL/min。检测波长为360 nm，柱温25℃，进样量为20μL。

2方法

2.1 FPLC(快速蛋白液相色谱)分析

小型猪血浆200µl，0.22µm滤器过滤后上样, 以500µl/min的速度自动收集所分离的组份, 每个组份500µl, 共收集35个组份。

2.2 VLDL的SDS-PAGE

分别采集转基因和非转基因小型猪血浆各5ml，缓慢加至含有5ml生理盐水的10ml离心管底部，各离心管称重配平，10℃、3.8X10

⁴ rpm超速离心18小时，离心结束后小心移取上层VLDL进行脱脂。聚丙烯酰胺梯度凝胶4%-18%，调整上样量，使甘油三酯等量。

3 结果

3.1 FPLC分析

在FPLC脂蛋白分析中, hApoCⅢ转基因小型猪血浆极低密度脂蛋白( very low density lipoprote in, VLDL)颗粒较非转基因小型猪显著增高(图1 B),但是胆固醇两者没有显著差异(图1 A)。

图1 血浆脂蛋白组分FPLC分析（ A-血浆胆固醇脂蛋白差异 B-血浆甘油三酯脂蛋白差异）

3.2 VLDL的分离

VLDL的SDS-PAGE分离电泳如图2所示，hApoCⅢ转基因小型猪血浆的ApoCⅢ表达量明显比非转基因猪多，但是两者的ApoE表达数量近似。

图 2 VLDL的SDS-PAGE（1-蛋白彩色marker，2-转基因猪，3-非转基因猪）

4 讨论

作为脂蛋白代谢之重要调节剂的ApoCⅢ，与高脂血症和心血管疾病密切相关^［12-14］。本研究中，hApoCⅢ不但在小型的猪肝脏^[和小肠进行了表达，而且小型猪VLDL/CM颗粒也显著增高，结果是其血浆甘油三酯的清除造成延迟。此一方面表明ApoCⅢ的过表达抑制了LPL的活性，进而减慢了VLDL/CM的分解，另一方面也显示ApoCⅢ极有可能作为１型糖尿病的一个有效治疗靶点^［15］。

FPLC是一种常用的中压液相色谱,由于其快速、简单, 很早就用于蛋白质的分离纯化。根据所要纯化的目的蛋白的特性, 利用FPLC结合不同的色谱柱分离纯化蛋白质的报道已屡见不鲜。本研究用FPLC分析转基因小型猪血浆脂蛋白，为深入研究提供了可能。

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^魏静元，理学博士，主要从事生物安全相关领域及人类疾病动物模型方面的研究。E-mail: 906017405@qq.com

基金项目：国家自然科学基金（No.31172172;No.31201874;No.31201761

），辽宁省博士启动基金计划（20121108），中国博士后科学基金（No.2011M500616,No.2012T50303）