HSYA对MSCs向神经元样细胞分化的保护作用

HSYA对MSCs向神经元样细胞分化的保护作用

宋小青,苏立宁,魏会平,常月锋

河北北方学院基础医学院河北张家口075000

项目来源：河北北方学院重大项目（项目编号：ZD120177）。

作者简介：宋小青（1978-），女，硕士，讲师，主要研究方向为细胞生物学

通讯作者：魏会平（1966-），女，学士，教授，主要研究方向为生物学。

摘要:探讨在MSCs向神经元样细胞分化过程中，A(HSYA)能否提高BME引起的细胞毒理作用的能力及HSYA的最佳保护剂量。MSCs贴壁后分7组处理，再进行活力检测，凋亡检测，各组细胞的SOD和GSH比活力或相对含量检测，NSE、MAP-2及其基因的表达检测。实验结果表明HSYA能显著提高细胞的相对活力、降低细胞凋亡率、并能维持细胞内较高的SOD/GSH水平，该组各测试数据均可达到Control-1的80%以上；与Control-2相比，经120mg/LHSYA保护后，分化后的神经元样细胞存活时间明显延长，NSE和MAP-2呈阳性表达，RT-PCR结果表明在3-7h内NSE和MAP-2的mRNA相对含量一直呈上升趋势。

关键词：羟基红花黄色素，间充质干细胞，β-巯基乙醇

【中图分类号】R329【文献标识码】A【文章编号】1001-5213(2016)09-0220-01

MSCs可分化为心肌细胞[1]、成骨细胞[2-3]、神经元样细胞[4-5]等；同时由于其取材方便、组织来源广且无显著的免疫原性[6]，已被看作是修复受损组织的“种子”细胞。本研究将初探HSYA能否提高细胞抵抗BME引起的细胞毒害作用的能力及最佳保护剂量，具体见下。

1实验材料

1.1动物

3-4周SD雄性大鼠，购于河北北方学院动物室。

1.2药品与试剂

L－DMEM、胎牛血清及胰蛋白酶、HSYA、β-巯基乙醇、bFGF、NGF、NSE、MAP-2及DAB试剂盒。

1.3主要仪器

安全工作柜、CO2细胞培养箱、流式细胞仪、分光光度计、酶标仪、倒置荧光显微镜、低温离心机、凝胶成像系统等。

2实验方法

2.1MSCs的培养及鉴定

无菌条件下，分离大鼠股骨，D-Hanks液冲洗后剪开股骨两端，注射器吸取约5mL的基本培养基冲洗骨髓腔，反复吹打后种植于25cm2的一次性培养瓶，置于37℃的恒温培养箱中培养。于第3d首次换液，以后每隔2~3d换液1次，直至细胞融合达85%以上，用0.25%的胰酶消化后进行传代。

培养至第3代时，经胰酶消化制成MSCs单细胞悬液并计数，利用D-Hanks（不含Ca2+、Mg2+）洗涤3次，然后分别加入10μl的CD29-PE，CD34-FITC，CD45-FITC和CD90-APC兔抗鼠单克隆抗体混匀，再用D-Hanks洗涤后经流式细胞仪进行检测分析。

2.2细胞活力及凋亡检测

取3thMSCs，贴壁后分7组处理：Control-1连续用基本培养基培养，Control-2先用基本培养基培养后，然后用预诱导培养基培养24h；5个HSYA保护组先用保护培养基培养24h，然后用预诱导培养基培养24h；处理完毕后每孔加20μlMTT溶液（5mg/ml），放入培养箱孵育4h后弃上清，每孔加入150μl的DMSO，室温震荡10min后放入酶标仪，在570nm波长处测OD值。

取3thMSCs爬片，经含有HSYA和BME的培养基分别处理24h后，用PI荧光染料进行染色处理，于荧光倒置显微镜下进行观并计算各组细胞的凋亡率。

2.3SOD和GSH活性检测

按照“方法2.2”分7组处理细胞并分别收集，采用反复冻融法处理所收集的细胞，研磨后加入缓冲液，按试剂盒说明书进行SOD和GSH活性测定，并通过考马斯亮蓝法进行蛋白含量标定。

2.4神经分化及免疫细胞化学鉴定

待3thMSCs爬片生长至60~70%时，采用含有最适HSYA保护浓度的保护培养基进行培养24h，然后加入预诱导培养基处理24h，最后更换为神经诱导培养基进行分化诱导，在分化诱导过程中要密切观察细胞的分化情况。

2.5RT-PCR检测NSE、MAP-2基因的表达变化

各引物的相关信息见表1。

4讨论

HSYA具有抗氧化、清除氧自由基及抗炎症作用等多种药理作用，同时其对免疫系统、心脑血管系统及神经系统均有一定的保护作用。

体外将MSCs诱导分化为神经元样细胞的方法较多，而BME+bFGF/EGF几乎成为一种经典，该方法具有诱导效率高，分化后的细胞中少有神经胶质细胞产生的优点，但其最大的缺点是分化后的细胞存活时间较短。本研究从增强分化前细胞的相对活力、抗氧化及抗凋亡能力等方面出发，旨在为细胞移植、基因转染等其他实验争取时间。实验结果发现，不同浓度的HSYA可不同程度地提高分化前细胞的相对活力和抗氧化力，其中以120mg/LHSYA的保护作用最为显著，且体外HSYA确实可以提高细胞的抗凋亡能力。

经120mg/LHSYA保护而分化产生的神经元样细胞存活时间较长，免疫细胞化学法检测发现，NSE和MAP-2均呈阳性表达。RT-PCR结果表明：相对Control-1而言，NSE和MAP-2基因在两组的表达量均有所升高，其中Control-2组的NSE和MAP-2基因在分化5h时相对含量最高，随后下降；而HSYA（120mg/L）组在3-7h内一直呈上升趋势。

本实验研究结果提示HSYA浓度在40～120mg/L的范围内，对细胞的保护作用与浓度变化呈正相关，可明显提高细胞抵抗BME引起的细胞毒理作用的能力，并能延长分化后神经元样细胞的存活时间，有利于获得分化成熟的神经元样细胞。

参考文献：

[1]徐隋意,李光来.葡萄籽原花青素对骨髓间充质干细胞诱导分化后神经元样细胞凋亡的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志,2010,8(3):333-335.

[2]侯兆阳,陈哲,魏家森.羟基红花黄色素A对急性脊髓损伤模型大鼠神经细胞凋亡的影响[J].浙江中西医结合杂志,2014,24(9):753-757.

[3]卞铁荣,王莉丽,邢宏运,等.生物复合材料体外诱导分化SD大鼠乳鼠骨髓间充质干细胞为成骨细胞分析[J].中国骨质疏松杂志,2014,20(8):885-889.

[4]黄家贵,沈长波,刘舒,等.白藜芦醇诱导大鼠骨髓基质细胞的神经元样细胞分化伴Shh信号激活[J].第三军医大学学报,2013,35(4):280-283.

[5]张勇,程敬亮,王娟,等.体外培养骨髓间充质干细胞诱导分化为神经样细胞的研究[J].中国实用神经疾病杂志,2011,14(3):39-41.

[6]朱海波,王振华,田京伟,等.羟基红花黄色素A对实验性脑缺血的保护作用[J].药学学报,2005,40(12):1144-1146.