热休克蛋白70在浸润性乳腺癌中的表达观察

热休克蛋白70在浸润性乳腺癌中的表达观察

朱长仁1徐清2张子兰2张智弘1*

（1.南京医科大学第一临床医学院2.江苏省苏北人民医院）

【摘要】目的:探讨热休克蛋白70(HSP70)在浸润性乳腺癌中的表达。方法:选取江苏省苏北人民医院2011年1月-2016年4月收治的103例浸润性乳腺癌及20例乳腺良性增生症患者，取标本送病理，采用westernblot和免疫组织化学法对标本HSP70表达情况进行检测，并进行统计学分析。结果:103例乳腺癌中86例细胞浆及细胞核内出现弥漫分布的棕黄色颗粒，HSP70染色阳性，17例为阴性，阳性表达率为83.5%；20例乳腺良性增生症中5例HSP70染色阳性，15例染色阴性，阳性表达率为25%。组间阳性率差异有统计学意义（p<0.05）。HSP70在乳腺癌中的表达明显高于在乳腺良性增生症中的表达（p<0.05）。HSP70表达量>3的患者发生腋窝和远处淋巴结转移率高于HSP70表达量<2者，组间差异有统计学意义（p<0.05）。结论:热休克蛋白70与浸润性乳腺癌有密切关系，与淋巴结转移率呈正相关关系。

【关键词】热休克蛋白；浸润性乳腺癌；乳腺良性增生症

近年研究发现，HSP70在肿瘤治疗中充当了多重重要的角色，一方面作为分子伴侣参与肿瘤细胞的功能代谢，保护肿瘤细胞免受有害因素的损害；另一方面肿瘤细胞与机体正常细生长、代谢、分化的异质性，使HSP70成为与其相结合的肿瘤抗原多肽的靶载体，在参与肿瘤抗原的免疫反应中充当了举足轻重的角色[1]。为了更好的认识和掌握乳腺癌，本试验通过免疫组化和免疫印记杂交法检测HSP70在浸润性乳腺癌中的表达，探讨HSP70的表达与浸润性乳腺癌的进展、治疗和预后的关系。

1资料与方法

1.1一般资料

收集江苏省苏北人民医院2015年9月至2016年2月临床资料齐备的浸润性乳腺癌手术标本103例，随机选取良性乳腺增生症标本20例作为对照组。所有标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋。所有病例均由两位高级职称病理诊断医师确诊，诊断依据参照WHO(2012)乳腺肿瘤组织学分类中乳腺癌的组织学诊断标准。103例乳腺癌中浸润性癌中，非特殊型80例、髓样癌3例、浸润性小叶癌13例、粘液癌4例、神经内分泌癌3例。本研究经本院伦理委员会批准，并签订医患知情同意书。观察组和对照组一般资料差异无统计学意义（p>0.05）。

1.2检测指标

采用免疫组化和蛋白印记杂交(westernblot)法检测两组患者HSP70表达情况。免疫组化按以下方法：首先用石蜡包埋后进行切片，依次进行脱蜡、过梯度酒精水化后放入3％的H2O2溶液中室温下放置10min；PBS冲洗3次，每次2min；然后将标本放入枸橼酸盐缓冲液中，加热10min行抗原修复；再于室温冷却20min；正常山羊血清封闭10min；加一抗，37℃孵育1h后用PBS冲洗3遍，每次5min；然后用生物素标记二抗，37℃孵育15min，PBS冲洗3遍，每次5min；加辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育15min后也用PBS冲洗3遍，逐片滴加底物燃料DAB，出现棕色沉淀后用双蒸水冲洗；然后用苏木精复染、梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片后镜检。HSP70以细胞中细胞浆或细胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞，切片中阳性细胞>10%为阳性。

蛋白免疫印迹杂交采用westernblot法。常规方法提取乳腺癌组织及乳腺良性增生症组织的标本。行SDS-PAGE电泳，转膜，5g/l脱脂奶粉封闭1h后，依次加入一抗和二抗，DAB显色后用相应软件对条带灰度进行分析。一抗和二抗由abcum公司提供，所有操作按说明书提供的方法进行实验。

1.3腋窝淋巴结和远处淋巴结转移观察

浸润性乳腺癌患者在乳腺癌根治术中清扫淋巴结，并切取腋窝淋巴结和锁骨上淋巴结标本，行病理冰冻切片，通过HE染色观察淋巴结转移阳性率。并根据乳腺癌组织HSP70的表达量进行分类，统计阳性率。乳腺良性增生症患者不检测淋巴结。

1.4统计学分析

采用SPSS17.0统计软件分析所有数据，计量资料以（x±s）表示，组间比较采用t检验或方差分析，计数资料用百分比表示，采用X2检验，p<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1两组免疫组化分析：

103例乳腺癌中86例细胞浆及细胞核内出现弥漫分布的棕黄色颗粒，HSP70染色阳性，见图abcd，17例为阴性，阳性表达率为83.5%；20例乳腺良性增生中5例HSP70染色阳性，15例染色阴性，阳性表达率为25%。组间阳性率差异有统计学意义（p<0.05）

3讨论

HSP70是热休克家族重要的成员之一，目前对它的研究也比较深入。正常情况下,HSP70在细胞内呈低表达，但在高温或其他各种有害应激状态下，HSP70的合成速度会显著增加，一般数分钟就能达到最高水平[2]。在乳腺癌的研究中，学者发现HSP70与乳腺癌细胞的生长和患者预后具有重要的关系。Ciocca等[3］用Westernblot检测了345例腋窝淋巴结转移阴性的原发乳腺癌患者的标本，结果发现HSP70表达越高，患者生存率越低，呈负相关关系。Lazaris等［4］也发现腋窝淋巴结转移越早，肿瘤分化程度越低，HSP70表达越高，同样呈负相关关系。本研究采用免疫组化和WB方法验证乳腺癌肿瘤组织及乳腺良性增生症组织中HSP70的表达，对判断肿瘤的转移和预后具有一定的参考意义。

本研究结果提示：103例乳腺癌中86例细胞浆及细胞核内出现弥漫分布的棕黄色颗粒，HSP70染色阳性，17例为阴性，阳性表达率为83.5%；20例乳腺良性增生中5例HSP70染色阳性，15例染色阴性，阳性表达率为25%。组间阳性率差异有统计学意义（p<0.05）。WB结果显示，HSP70在乳腺癌中的表达明显高于在乳腺良性增生症中的表达，这与免疫组化结果相对应。同时在淋巴结转移统计中发现，HSP70表达量>3患者发生腋窝和远处淋巴结转移率高于HSP70表达量<2者。结果说明，HSP70与病灶的恶性程度呈正相关关系。HSP70表达越高，阳性细胞数越多，则肿瘤恶性程度越高，越容易早期发生转移。其机制与HSP70残余肿瘤细胞的代谢有关。HSP70可参与糖皮质激素受体通路[5]和AKT信号通路[6]的功能调节，可促进葡萄糖代谢，从而促使肿瘤细胞增殖和迁移，并减少肿瘤细胞凋亡。当乳腺癌组织中血管形成不良时，乳腺癌细胞内会形成低葡萄糖、缺氧、酸中毒的特殊微环境，引起大量错误折叠或未折叠蛋白积聚，诱发非折叠蛋白反应(UPR)，也刺激了HSP70的大量表达[7]。同时，HSP70表达升高也可在一定程度上促进乳腺癌细胞增殖，加快乳腺癌组织内血管生成，而在乳腺良性增生症患者标本中，难以发现这一现象。另外，研究发现，HSP70可以改变细胞粘附性，造成钙粘素-连接素复合物的缺失，从而降低细胞粘附性，引起肿瘤的侵袭转移[8]。这也是本研究出现乳腺癌患者肿瘤早期转移率与HSP70表达呈正相关的原因之一。但具体机制还需要进一步研究。

综上所述，乳腺癌组织中HSP70表达明显高于乳腺良性增生症组织，同时与乳腺癌组织的腋窝淋巴结转移率呈正比。但乳腺癌患者放疗和化疗前后HSP70表达的变化与预后密切相关，这需要本课题组下一步研究，同时，HSP70导致肿瘤预后较差的机制很复杂，还需要更多深入研究进行探讨。

参考文献：

[1]YangZ,LuY,LiuJ,etal.Thechaperone-likeactivityofratHspB8/Hsp22anddynamicmoleculartransitionrelatedtooligomericarchitecturesinvitro[J].ProteinPeptLett,2012,19(3):353-359.

[2]KangSH,LeeJH,ChoiKH,etal.RolesofERKandNF-κBinInterleukin-8ExpressioninResponsetoHeatShockProtein22inVascularSmoothMuscleCells[J].KoreanJPhysiolPharmacol,2008,12(4):171-176.

[3]CioccaDR，ClarkGM，TandonAK,etal.Heatshockproteinhsp70inpatientswithaxillarylymphnode-negativebreastcance:prognosticimplications[J].JNatlCancerInst,1993,85(7):570-574.

[4]LazarisAC,ChatzigianniEB,PanoussopoulosD,etal.Proliferatingcellnuclearantigenandheatshockprotein70immunolocalizationininvasiveductalbreastcancernototherwisespecified[J].BreastCancerResTreat，1997，43(1):43-51.

[5]ZhouJB,XuPX,YiHM,etal.UpregulationofGp96correlateswiththeradiosensitivityandfive-yearsurvivalrateofnasopharyngealcarcinoma[J].ORLJOtorhinolaryngolRelatSpec,2012,74(3):164-171．

[6]WangXP,WangQX,LinHP.Correlationbetweenclinicopathologyandexpressionofheatshockrrotein72andglycoprotein96inhumanesophagealsquamouscellcarcinoma[J].ClinDevImmunol,2010,2010:212537.

[7]ChengCW,LiuYF,YuJC,etal.PrognosticsignificanceofcyclinD1,β-catenin,andMTA1inpatientswithinvasiveductalcarcino?maofthebreast[J].AnnSurgOncol,2012,19(13):4129-4139.

[8]GomesLR,TerraLF,WailemannRA,etal.TGF-β1modulatesthehomeostasisbetweenMMPsandMMPinhibitorsthroughp38MAPKandERK1/2inhighlyinvasivebreastcancercells[J].BMCCancer,2012,19,12:26.

通讯作者：张智弘