聚合酶链技术检测肝硬化患者腹水中细菌DNA的研究

聚合酶链技术检测肝硬化患者腹水中细菌DNA的研究

李胜男

李胜男

天津市第二人民医院300192

摘要：目的分析聚合酶链对肝硬化患者腹水细菌DNA的检测效果。方法选择细菌通用引物，引入到16SrRNA基因保守区，本次研究中，选择48例腹水样本，对样本行PCR扩增处理和阳性阴性对照实验。分析实验结果。结果在分析48例标本时，在15例标本中获得了370bpDNA片段，进过检测，阳性率为31.25%。而阴性和空白对照标本则并未体现出特异性。在PCR扩增后，可以检测出10pgDNA。结论在肝硬化腹水患者的检测中，采用聚合酶链技术，可以达到特异性和敏感性的需求，便于检测患者的细菌情况，具有较高的临床诊断价值。

关键词：肝硬化；细菌易位；聚合酶链技术；16S核糖体RNA基因

随着医疗事业的不断发展，对细菌易位的研究不断深入，以往主要集中在对活性肠道菌通过肠道屏蔽的研究，而现阶段，则逐渐扩展到对其他器官的研究[1-2]，延伸到细菌释放产物的易位。本研究尝试从细菌DNA水平探讨细菌易位的发生。

1对象与方法

1.1病例选择

研究时间为2015年8月-2017年2月，研究地点为天津市第二人民医院，在肝病科室选择48例肝硬化合并腹水患者，其中男性39例，女性9例，年龄26-69岁，平均54.5岁，纳入标准：（1）患者经过临床诊断确诊为肝硬化合并腹水；（2）患者及其家属同意本次研究且签署知情同意书。排除标准：（1）患者入院前14d内使用抗生素；（2）继发性腹膜炎患者。

1.2研究方法

1.2.1标本采集在患者住院时，当天抽取患者腹水，对腹水进行常规检查，采用需氧菌培养和厌氧菌培养模式，另外，选择10ml腹水，分别装在5个2ml的试管，放置在-70℃的环境保存。腹水标本采集均于使用抗生素之前进行。阳性对照菌选取常见引起临床细菌感染的菌株。

1.2.2检测试剂PCR扩增仪、GELDOC-200型凝胶成像系统、紫外分光光度计、UNIQ-10柱式临床样品基因组抽提试剂盒（SK1341）及HBV-DNA荧光定量检测试剂盒（上海生工生物工程有限公司）、Taq酶D334A及DL1000DNAMarker（大连宝生物技术有限公司）。

1.2.3引物设计文献[3]的学者在研究过程中，对引物进行设计，采用北京华大公司生产的引物进行合成和纯化处理，经过分析，发现其正向序列为，反向序列为，在片段长度方面，整体扩增了370bp。

1.2.4DNA提取参照上海生工生物工程有限公司UNIQ-10柱式临床样品基因组抽提试剂盒（SK1341）说明书进行腹水标本、阳性对照菌株、白色念珠菌及人基因组DNA的提取，HBV-DNA提取按照HBV-DNA荧光定量检测试剂盒说明书提取。

1.2.5PCR扩增分析与测序研究

本次实验中，PCR的反应体系设计为25μL，包括

（1）12.5μL的TaqDNA聚合酶。

（2）7.5μL的灭菌双蒸水。

（3）1μL的上游引物和下游引物。

（4）3ul的模板。

在反应条件的设计方面，设计为95℃，在反应4min后，进入循环，保证循环模板在94℃的环境下运行30s，之后进行退火处理，在55℃的环境下保存30s；之后将引物延伸到72℃的环境中，持续60s，共开展30个循环，最后，将引物放置在72℃的环境下持续7min。对引物开展阳性、空白和阴性检测，通过琼脂糖凝胶电泳的方式来扩增。选择GELDOC-200设备记录成像。如果琼脂糖凝胶显示为阳性，则证明腹水中包括DNA，则完成本次实验。

2结果

2.1PCR扩增结果分析

本次研究中，分析48份样本，其有15份为阳性，琼脂糖凝胶电泳结果见图1。

图1腹水细菌DNA阳性标本电泳结果（M为DL1000marker、

1-15代表腹水DNA阳性标本、16是阴性对照、17代表空白对照）

2.2样本特异性分析

本次研究中，对10种菌株进行检测，并且进行PCR扩增处理，在370bp位置，发现存在DNA条带，通过分析发现，白色念珠菌提取DNA，并且实现扩增，但是并未发现特异性的条带，具体结果如图2。

图2阳性、阴性及空白对照电泳结果（1-10为阳性对照、11-13为阴性对照、14为空白对照）

2.3实验敏感性

10-6g/ul-10-12g/ul浓度测试中，经过电泳分析，发现在370bp位置发现特异性条带，但是在10-13g/ul浓度以下并未发现，因此，通过结果的分析，认为10pg是最低的检测浓度。如图3所示。

图3实验敏感度（1-10分别代表10-6g/ul-10-15g/ul浓度的DNA标本）

3讨论

本研究通过在细菌16SrRNA基因保守区在处理过程中，对10株进行引物扩增，获取阳性DNA诊断结果，发现其与GBV-DNA并无明显的交叉，在倍比稀释的方法下，确定10pg是最低的检测浓度，因此，通过分析发现，该方法用于肝硬化检测具有较高的价值。

参考文献：

[1]申红霞，娄小平，苌新伟，等.肝硬化患者自发性细菌性腹膜炎危险因素的Meta分析[J].世界华人消化杂志，2016，24（12）：1903-1909.

[2]杨大明，孟宪镛.自发性细菌性腹膜炎研究进展.国外医学内科分册，2002，29：345-348.

[3]袁春，黄长形，连建奇.PCR测肝硬化腹水中细菌DNA的研究[J].透析与人工器官，2007，3（18）：20-24.