皮肤组织病理制片的技术要领

皮肤组织病理制片的技术要领

贾文娟李鹏

天津市中医药研究院附属医院病理科

摘要：皮肤病理是皮肤科的重要组成，没有高质量的皮肤病理切片和染色，就难以作出正确的病理诊断，本文总结了制片技术要领以尽量避免皮肤组织病理制片质量不高可能导致的误诊、误治。

关键词：皮肤组织；病理制片

皮肤组织的特殊结构导致皮肤病理制片是病理制片中的一大难题，皮肤组织大致分为表皮、真皮、皮下组织、皮肤附属器等复杂结构。表皮层细胞较多、结构致密、组织较硬；真皮层主要由胶原纤维、弹力纤维、网状纤维与基质构成；皮下组织主要为脂肪，细胞少，结构疏松，这些组织致密程度不尽相同，给制片增加了相当大的难度。高质量的皮肤病理切片要经过取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色等多个步骤环环相扣而制成，每个步骤的具体技术要领如下：

1、取材

皮肤组织的活检取材与病理诊断有关，一般的皮损取材我们应有所了解，如：常见的水疱要取24小时以内发生的新鲜水疱，保持疱壁完整；环状皮疹要取边缘部位；皮下结节性损害要深取到皮下脂肪层；根治的肿瘤标本要取肿瘤中间及周边多处组织，判定肿瘤是否切除干净，切忌在活检时对组织挤压；组织切取大小不超过1.5cm╳1.5cm╳0.2cm，取材后要及时进行组织固定。

2、固定

一张好的皮肤病理切片与组织的固定密切相关。常规组织固定液为10%甲醛溶液或中性甲醛溶液。标本必须充分固定，一般要求固定在3小时以上。10%甲醛溶液或中性甲醛溶液不仅要存组织细胞形态结构的完整性，同时还要保存组织细胞的抗原性。

3、脱水、透明

脱水酒精应从低浓度逐步至高浓度将组织内的水分逐步置换出来，为了避免皮肤组织过渡收缩变硬，要求脱水酒精的浓度梯度要小，具体步骤：AF液1.5小时，80%酒精1.5小时，85%酒精1.5小时，90%酒精1.5小时，95%酒精ⅠⅡ各2小时，无水酒精ⅠⅡ各2小时，二甲苯ⅠⅡ各2小时，脱水的时间应根据标本的大小和厚度酌情而定。脱水必须彻底，否则切片会出现凹陷，且影响染色效果。为保证制片质量，脱水剂应定期更换。

4、浸蜡

浸蜡的关键：一是要注意时间的掌握，由于皮肤组织结构致密并含有脂肪，组织不易渗透，如果组织浸蜡时间过长，易造成组织块分离，蜡块内产生气泡、裂隙、破碎等。反之，蜡液不易渗透到组织深部，组织块硬度不均匀，造成切片厚薄不一，影响切片质量及染色效果。二是要掌握浸蜡温度，要求温度高于石蜡熔点，一般为（65-70℃），温度过高，会破坏组织中的抗原，使免疫组化酶标记染色受到影响。石蜡液ⅠⅡⅢ各1.5小时，注意浸蜡用蜡与包埋用蜡应为同等密度，同等熔点的切片石蜡，以保证蜡块与组织硬度一致，以上步骤均在自动脱水机中完成。

5、包埋

皮肤组织相对较坚韧，包埋用的石蜡熔点应略高（59~62）℃；在包埋石蜡液中可加入少量蜂蜡（2%为宜）以增加蜡带的柔韧性，尽量保证组织和石蜡的硬度一致，有助于切片；包埋时应注意皮肤组织标本表皮与包埋板呈垂直方向，且组织标本上下切面与包埋板平整摆放（紧贴包埋板）不得随意摆放。包埋操作过程要迅速，包埋时石蜡温度应与组织温度相近，不然会引起组织与周围石蜡脱裂，影响制片质量。

6、切片

切片时切片机夹口牢固夹持蜡块；在夹持蜡块时皮肤表皮面朝上，组织面要与切片刀口平行；要求用力平和速度均一，切片过程中可将蜡块放至冰格中冷冻后或用小冰块不断冷却蜡块，使切片更顺利。切片厚度一般在4～5μm；由于皮肤组织多数均带有表皮较内脏组织切片过程更易磨损刀片，为保证切片质量，要及时更换刀片，否则切片易卷起或出现刀痕影响切片质量，锋利的切片刀是保证切出完整、连续切片的前提。

7、裱片、捞片

裱片温度以40一45℃为宜，温度过高蜡带易产生气泡和使组织散裂，温度过低蜡带不易伸展；。捞片时用洁净并写好编号的载玻片进行贴片，载玻片与切片几乎成直角进入水中捞起，要求表皮朝上，贴在载玻片的中下l／3处，，每张切片要4~6个切面为宜，横向纵向观察均呈一直线，易于观察，玻片与切片之间最好不要有水滴，捞起后及时将玻片放在烘片机上烘干。

8、染色

染色是决定制片质量优劣的重要环节，稍不注意将影响观察效果，为提高切片着色效果，染色前必须彻底脱蜡，脱蜡时将提篮整体上下或左右晃动加快脱蜡速度，脱蜡用的二甲苯应定期更换。

常规染色采用苏木素伊红（HE）染色法：Gill改良苏木素配方：苏木素2g；无水乙醇250ml；硫酸铝钾17g；蒸馏水750ml；碘酸钠0.2g；冰醋酸20ml；先用无水乙醇溶解苏木素，用蒸馏水溶解硫酸铝钾，然后将两液混合，再依次加入碘酸钠和冰醋酸，使用前过滤。苏木素染液在新配制时，由于着色力极强，可以相应缩短染色时间，以后随使用时间延长，可适当延长染色时间；当胞核着色不鲜艳、呈灰蓝色时，染液应及时更换。苏木素染液使用一段时间后，表面会出现亮晶状漂浮物，这是液体表面的过氧化物，必须过滤，否则沾于组织上不易去掉。

伊红液的配方：伊红-Y1g；重鉻酸钾0.5g；无水乙醇10ml；饱和苦味酸10ml；蒸馏水80ml；无水乙醇溶解伊红-Y，蒸馏水溶解重鉻酸钾，以上两液混合，同时加入苦味酸，使用前过滤。此配方的特点：着色快，颜色鲜艳，并可保存15年以上。伊红染液的染色时间30秒-1分钟，不宜过染，否则造成间质与实质不分明，达不到红蓝相映之目的。

在HE染色中盐酸酒精分化是关键步骤，分化适度，恰到好处。二甲苯透明切片浓度要纯，无杂质，使切片充分透明。染色结果应使细胞核与细胞浆呈蓝红相映，色泽鲜艳，核膜及核染色体颗粒均清晰可见。

9、封片

封片应在切片上的二甲苯干之前封同，否则，切片中易出现色素，滴上浓稀适度的中性树胶，快速盖上干净、大于组织块的盖玻片，中性树胶滴得不宜太多和太少，以不溢出盖玻片外为佳，并注意不要留气泡在切片内。把封好的片子放在晾片板上自然晾干，以备镜下观察。

讨论

通过以上方法制作的皮肤病理标本保存时间长、制作切片时组织不宜脆裂，染色后组织结构完整、色泽鲜艳，制片后在同一张片子上能观察到表皮、真皮和皮下组织结构。一张优质的皮肤病理切片将有利于皮肤病理医师的镜下观察和诊断，从而要求病理技术人员在工作中养成严谨、科学、认真的工作态度，注意及时总结，积累经验，为病理诊断医师提供优质、高质量的皮肤病理切片。

参考文献：

[1]石岩，靳颖，普雄明，皮肤病理切片制作过程中的几点体会，新疆医学2008年第38卷。

[2]钟白玉，唐书谦，郝飞，杨希川，皮肤病理切片制作特点与质量控制，实用皮肤病学杂志2008年6月第1卷第2期。