研讨低纯度糖蜜酒精发酵中青霉素的应用

研讨低纯度糖蜜酒精发酵中青霉素的应用

张志凌

（国投生物能源（铁岭）有限公司辽宁铁岭112700）

摘要：本文分析总结了青霉素在低纯度糖蜜酒精发酵中的应用现状以及制约因素，同时对安全杀菌技术进行了介绍，以期为糖蜜酒精发酵寻找安全杀菌或抑菌技术提供参考，促进酒精工业健康发展。

关键词：低纯度；糖蜜；酒精发酵；青霉素；应用

1青霉素杀菌机理

抗生素杀菌作用主要有4种机制：抑制细胞壁的合成、与细胞膜的相互作用、干扰蛋白质的合成以及抑制核酸的转录和复制。青霉素的杀菌机理主要是抑制细菌细胞壁的合成，革兰氏阳性细菌细胞壁主要由肽聚糖构成，合成肽聚糖的前体物，需要在转肽酶的作用下才能交互联结形成网络状细胞壁。由于青霉素的化学结构与合成肽聚糖的前体物的结构部分相似，能与构成细菌细胞壁肽聚糖的前体物质竞争转肽酶，因而使合成肽聚糖的生化过程受阻碍，不能形成肽聚糖，造成细胞壁缺损，使菌体失去屏障保护，最后由于菌体内渗透压高，使水分不断渗入，最终使细胞膜破裂，发生溶菌作用，导致细菌死亡，因此革兰氏阳性菌对青霉素敏感。

2青霉素的检测方法

2.1生物测定法

生物测定法主要有微生物测定法、放射受体测定法。微生物测定法是一种比较传统的抗生素残留检测方法，其测定原理是根据抗生素对微生物的生理机能、代谢的抑制作用来定性或定量确定抗微生物药物残留。其优点是费用低，一般实验室都能操作，但是检测时间长，显色状态判断通过肉眼辨别易产生误差。微生物测定法较常用的方法有纸片（PD）法，氯化三苯基四氮唑（TTC）法等。欧洲国家常采用纸片法，我国常采用国标TTC法。

2.2免疫法

免疫分析法是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术。免疫法包括放射免疫法、荧光免疫法、酶联免疫法、胶体金免疫层析法。免疫分析技术最突出的优点是操作简单、速度快、分析成本低。其取样量小，前处理简单，容量大，仪器化程度较低，检测灵敏度较高，是目前使用最广泛、快速、灵敏的检测抗生素残留的方法。该法适用于现场监控和大量样品的筛选，具有广阔的应用前景。但由于免疫分析法是配体结合反应，线性范围较窄，并且有个体差异的存在，在检测过程中也容易出现假阳性。

2.3理化仪器分析法

2.3.1高效液相色谱法

高效液相色谱（HPLC）是一种快速分离分析技术，引入了气相色谱理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，分离速度快、效率高，操作自动化。20世纪末，高效液相色谱成为青霉素类残留检测中应用最广泛的检测技术。相关资料用带紫外检测器的液相色谱仪检测老鼠血清中阿莫西林含量，样品在波长210nm条件下进行检测，最低定量限200ng/mL。相关资料采用氯化汞柱前衍生化后，用HPLC法，荧光检测器检测羊血清和组织液中阿莫西林的定量限分别为100和200ng/mL。

2.3.2色谱-质谱联用技术

色谱-质谱联用技术集分离、定量和定性于一体，适用于确证性分析。常见联用技术有气相色谱-质谱（GC-MS）、液相色谱-质谱（LC-MS）、毛细管电泳-质谱（CE-MS）、高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）等。由于青霉素类抗生素本身不易气化，应用GC-MS检测需进行甲酯化，该种方法前处理过程复杂，一般不常用。利用CE-MS检测青霉素类药物是一种很有前景的方法，但目前尚未普及。目前应用较多的是液相色谱-质谱（LC-MS），常用于牛奶、乳制品、农产品和工业废液等抗生素残留的检测。

3酒精发酵杀菌中青霉素及复合抗生素的应用

3.1青霉素在酒精发酵中的应用

青霉素属于β-内酰胺类抗生素，分子式为：C16H18N2O4S。酒精发酵使用以青霉素为主的抗生素杀菌由来已久：相关资料按每毫升0.6～1.2U的量把青霉素加入到发酵醪及酒母醪中，抑制杂菌效果非常明显，青霉素的加入量应适当，过少不能达到灭菌效果，过多则会造成浪费。相关资料采用青霉素替代硫酸，使用量为0.5～1U/mL，可以有效地抑制杂菌污染，提高酒母质量，特别在夏季使用、效果更为明显。

3.2复合抗生素在酒精发酵中的应用

随着糖蜜纯度降低，糖蜜中带菌情况日益严重，在糖蜜酒精生产中，青霉素使用量也不断加大，从原来的1～3U/mL用量，逐渐增加用量到目前的8～10U/mL，单一抗生素杀菌很容易出现抗药性，这是目前普遍存在的问题。采用几种抗生素或杀菌剂联用，可有效缓解抗药性，杀菌效果更好。相关资料研究了青霉素、安菌泰、莫能菌素等3种杀菌剂在木薯酒精发酵中的杀菌效果。3种杀菌剂都能有效杀菌，要在发酵初期添加，添加量不超过10mg/L，否则会对酵母产生抑制作用。发酵过程中3种杀菌剂交替使用，避免使用同一种杀菌剂产生抗药性的问题。相关资料在15L发酵罐中进行玉米酒精高浓发酵。采用链霉素1.4U/mL，土霉素0.7U/mL，青霉素0.9U/mL组成的优化复合抗生素，抑菌效果明显，最终酒精度达到了17.2%，挥发酸0.20mg/L。三种抗生素的联合使用，增强了抑菌的效果，避免了抗药性的问题，采用复合抗生素杀菌是缓解抗药性的有效手段。目前国内市面常用的酒精发酵杀菌剂产品大都是复合抗生素和防腐剂。

4抗生素在酒精发酵应用的制约因素

4.1抗生素潜在污染风险

目前以青霉素为主抗生素普遍应用在酒精发酵杀菌。虽然青霉素沸点较高，不会通过蒸馏进入酒精产品中，但许多证据表明，工业抗生素的滥用会污染地表水、地下水和土壤。根据中国科学院广州地球化学研究所应光国的研究报告“抗生素环境浓度地图”，抗生素污染在中国主要河流环境普遍存在。抗生素污染可能会进入水体和土壤中，又通过食物再回到人体，从而增加人和动物的耐药性，这可能导致人类陷入“无药可用”的境地；巴西在酒精生产中使用抗生素，酒精废液用于甘蔗农场施肥，现已从该甘蔗农业生态系统中分离出多抗性细菌73例，有86%的菌株能在100U/mL青霉素下存活。2005年底，用于作为动物饲料的复合物，欧盟已不允许其发酵产物有抗生素残留。抗生素及降解物有可能进入土壤和水体，这会逐渐威胁到人类饮水安全和疾病防控。因此寻找安全天然杀菌剂和抑菌技术替代抗生素是未来研究的关键。

4.2低纯度糖蜜发酵酒精与抗生素的使用

低纯度糖蜜发酵酒精染菌是目前糖蜜酒精厂面临的严峻问题，由于青霉素等抗生素长期使用会产生抗药性，为了抑制杂菌，通常会添加更多抗生素和硫酸，硫酸用量增加会和糖蜜中的钙盐产生更多的硫酸钙沉淀，造成糖蜜酒精生产设备结垢，结垢又影响生产连续性，反过来更容易感染杂菌，如此恶性循环。为应对结垢，出现糖蜜无酸发酵技术，即以青霉素等抗生素和发酵复合酶替代硫酸抑制杂菌。此种无酸发酵在糖蜜纯度较高的厂，抗生素可以有效抑制细菌和延缓结垢，酒精可以生产正常；但对糖蜜纯度较低的厂，无酸发酵无法正常运行。究其原因，对低纯度糖蜜，添加硫酸除了抑制杂菌，还可以澄清糖蜜，排除糖蜜中部分灰分、胶体和焦糖等发酵抑制物。因此，对低纯度糖蜜发酵酒精，不能只用抗生素杀菌，应该结合硫酸酸化抑制杂菌和澄清糖蜜。

5展望

由于酒精发酵使用抗生素的抗药性和污染风险，寻找安全杀菌或抑菌技术是未来酒精行业研究的方向，未来糖蜜酒精发酵杀菌技术发展一个方向是针对原料糖蜜的杀菌，另一方向发酵过程抑菌。针对糖蜜原料杀菌，比较可行的方案是高浓度糖蜜快速澄清技术。高浓度糖蜜快速澄清技术是在糖蜜中添加少量硫酸调整pH值，适当加热，短时间内快速澄清糖蜜中的灰分、胶体和焦糖，既能起到糖蜜灭菌作用，也实现了糖蜜中灰分和胶体等抑制酵母发酵杂质的排除。采用此技术处理过的糖蜜用于酒精发酵，有望彻底解决低纯度糖蜜发酵染菌和结垢问题，也有利于实现高浓度糖蜜发酵酒精。

参考文献：

[1]吕惠序.青霉素类药物的应用要点[J].兽药市场指南，2010（5）：41-43.

[2]尚红岩，姚和平，高亚飞，等.高浓度糖蜜快速热澄清发酵酒精技术的研究[J].甘蔗糖业，2016（3）：28-31.