非达霉素的菌种选育及发酵工艺优化

非达霉素的菌种选育及发酵工艺优化

赵金科

（苏州金盟生物技术有限公司）

【摘要】非达霉素是一种大环内酯类抗生素，在体内可生成仍具活性的代谢物OP-1118。发酵效价测定：卡赛帕克C18MGⅡ液相色谱柱（4.6×250mm5µm），甲醇-0.1%甲酸(60：40)，检测波长为228nm，流速为1.0ml/min，柱温为25℃。本实验对非达霉素高产菌株选育并通过不同碳源、麸质粉使用量等以发酵效价为指标对非达霉素发酵工艺进行研究。

【关键词】非达霉素；工艺；研究

[中图分类号]R2[文献标号]A[文章编号]2095-7165（2018）21-0672-02

非达霉素(fidaxomicin，Dificid),属于新18元大环内酯化合物,于2011年5月27日获FDA批准。非达霉素是一种大环内酯类抗生素，在体内可生成仍具活性的代谢物OP-1118，其治疗艰难梭菌感染优于现有药物[1-4]。艰难梭菌已经超过抗甲氧西林金黄色葡萄球菌，是目前医院内获得性感染的主要原因[5]。本实验对非达霉素高产菌株选育并通过不同碳源、不同蛋白胨含量等以发酵效价为指标对非达霉素发酵工艺进行研究。

1材料和方法

1.1菌种

桔橙指孢囊菌(Dactylosporangiumaurantiacum)。

1.2材料与试剂

葡萄糖（梁山科泰生物制品有限公司）、麦芽浸粉（梁山科泰生物制品有限公司）、琼脂（梁山蛋白胨生物工程有限公司）、酵母提取粉（梁山科泰生物制品有限公司）、硫酸镁（山东昌乐鼎博化工有限公司）、乳糖（山东昌乐鼎博化工有限公司）、碳酸钙（山东昌乐鼎博化工有限公司）、麸质粉（济宁双华工贸有限公司）、酵母粉（梁山蛋白胨生物工程有限公司）、甘油（山东昌乐鼎博化工有限公司）、玉米淀粉（梁山科泰生物制品有限公司）、胰蛋白胨（梁山蛋白胨生物工程有限公司）、牛肉浸膏（梁山科泰生物制品有限公司）。甲醇（南通润丰石油化工有限公司）、甲酸（南通润丰石油化工有限公司）、乙腈（南通润丰石油化工有限公司）、乙醇（南通润丰石油化工有限公司）。

1.3仪器

KQ5200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；PHS-25C台式酸度计（常州金坛精达仪器制造有限公司）；LAB-UPH-10T高端型实验室超纯水机（台上式）（四川兰博环保设备有限公司）；723PC扫描型可见分光光度计(上海虔钧科学仪器有限公司);实验室培养箱（北京博劢行仪器有限公司）；恒温振荡器摇床（常州万科仪器科技有限公司）；COS-2102GZ大容量光照摇床（上海左乐仪器有限公司）；DW-9型自动培养基分装器（杭州大微生物技术有限公司）；JDS-2B双功能冷冻水浴恒温振荡器（常州金坛精达仪器制造有限公司）；Plus-E3超纯水机实验室级超纯水机（南京易普易达科技发展有限公司）；恒温恒湿试验箱（上海巨怡环境试验设备有限公司）；分析天平（常州市幸运电子设备有限公司）；PC-220色谱柱恒温箱（天津艾维欧科技发展有限公司）；卡赛帕克C18MGⅡ液相色谱柱（4.6×250mm5µm）。

1.4培养基及培养条件

1.4.1固体培养基：葡萄糖:麦芽浸粉:琼脂:酵母提取粉(4.0:10:20：4)，PH7.0，湿热灭菌二十分钟。

1.4.2发酵培养基：硫酸镁：乳糖:碳酸钙：麸质粉：酵母粉：甘油（2.0：60：4.0：10.0：10.0：20.0）PH7.0，湿热灭菌二十分钟。

1.4.3种子培养基：葡萄糖:酵母粉：硫酸镁：玉米淀粉:碳酸钙:胰蛋白胨：牛肉浸膏

（1.0：5.0：2.0：24:4.0:5:3.0），PH7.0，湿热灭菌二十分钟。

1.5分析方法

pH测定：酸度计测定。

发酵效价测定：高效液色谱法，卡赛帕克C18MGⅡ液相色谱柱（4.6×250mm5µm），甲醇-0.1%甲酸(60：40)，检测波长为228nm，流速为1.0ml/min，柱温为25℃。

1.6诱变处理

将金色链霉菌新鲜斜面孢子制成单孢子悬浮液,采用紫外线诱变。经紫外线诱变后的存活孢子涂于含链霉素的平板上,培养，孢子成熟后经摇瓶发酵进行初筛和复筛。

2结果与讨论

2.1高产菌株选育

本实验桔橙指孢囊菌经自然分离,得非达霉素高产菌株。

2.2不同碳源对GDM生物合成的影响

本实验分别采用果糖、麦芽糖、葡萄糖、糊精、蔗糖、乳糖、甘露醇等作为唯一碳源进行试验。结果表明使用乳糖时效价较高。

2.3麸质粉使用量对生物合成的影响

本实验分别采用不同含量的麸质粉进行试验，研究其对生物合成的影响。麸质粉使用量配比为0.9%时，三次实验的产量分别为2220μg/mL、2250μg/mL、2100μg/mL，平均为2190μg/mL。麸质粉配比为1.1%时，三次实验的产量分别为2320μg/mL、2300μg/mL、2290μg/mL，平均为2303μg/mL。麸质粉配比为1.3%时，三次实验的产量分别为2100μg/mL、2110μg/mL、2000μg/mL，平均为2070μg/mL。试验结果表明蛋白胨含量为1.1％产量最高。

参考文献

[1]非达霉素与万古霉素治疗艰难梭菌感染的有效性和安全性比较:系统评价和荟萃分析(英文)[J].叶志康,唐惠林,段京莉,翟所迪.JournalofChinesePharmaceuticalSciences.2013(06)

[2]万古霉素和非达霉素对艰难梭菌体外抗菌活性的稳定性[J].赵杏珍,赵建宏,魏宏莲,杨靖,李志荣,强翠欣,李茹鑫,王晓明,赵宝鑫,翟宇.中国感染控制杂志.2018(06)

[3]抗感染新药非达霉素的药理作用与临床评价[J].姜春梅,刘洋,王京晶,张清,康博欣.中国新药杂志.2011(23)

[4]非达霉素和万古霉素对黄金地鼠艰难梭菌相关性腹泻动物模型治疗效果的评价[A].强翠欣,杨靖,白玉,田甜甜,李志荣,徐凯悦,崔庆庆,王倩,张娟,赵建宏.第六届中国临床微生物学大会暨微生物学与免疫学论坛论文汇编[C].2015

[5]艰难梭菌在健康人群中的定植与感染防控策略[A].田甜甜,赵建宏.中华医学会第十二次全国临床微生物学术年会暨第十一次全球华人临床微生物学与感染症学术年会论文汇编[C].2015