耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药特征

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药特征

朱青川

朱青川(福建省漳州市中医院检验科363000)

【摘要】目的了解耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的耐药性方法采用纸片扩散法检测MRSA对抗菌药物的耐药分析。结果MRSA的检出率为34.13%(43/126),多数菌株具有多重耐药性,但对万古霉素、氯霉素和复方磺胺甲口恶唑较为敏感。结论MRSA具有多重耐药的特征。

【关键词】葡萄球菌金黄色耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌(SAU)是临床上常见病原菌,其对抗菌药物的耐药性日趋严重,特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的出现及流行,使得原来用于治疗该类细菌感染的多种抗菌药物,如β-内酰胺类、酶抑制剂复合抗菌药物及碳青酶烯类药物不再具有疗效。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是医院内感染常见的病原菌之一,检出的MRSA一般呈多重耐药性,增加了治疗困难,已成为日益严重的临床问题。有关医院内感染中MR-SA研究的报道较多[１-２],MRSA的甲氧西林耐药决定簇(methicillinresistantdeterminant,mecA)位于葡萄球菌盒染色体mec(staphylococcalcassettechromosomemec,SCCmec)上,该结构类似于转座子,可以介导mecA基因游离传播,使敏感的葡萄球菌获得甲氧西林耐药性;部分SCCmec还携带有其他多种耐药基因,是MRSA多重耐药性产生的重要遗传学基础[3-4]。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株来源2005年6月—2006年6月,广州、深圳和湖南省部分地区临床分离的金黄色葡萄球菌(无重复)共126株,分离自126例患者。其中116例依据2006年9月卫生部颁布的《医院感染管理办法》附则确定为医院内获得性感染。采用法国生物梅里埃APIStaph试条进行细菌鉴定。金黄色葡萄球菌质控菌株为ATCC25923。

1.1.2试剂与药敏纸片青霉素(PEN)、苯唑西林(OXA)、头孢西丁(FOX)、红霉素(ERY)、克林霉素(CLI)、氯霉素(CHL)、环丙沙星(CIP)、阿米卡星(AMK)、妥布霉素(TOB)、庆大霉素(GEN)、利福平(RIF)、四环素(TET)、复方磺胺甲口恶唑(SXT)和万古霉素(VAN)药敏纸片及MH(MuellerHinton)琼脂或肉汤培养基,为英国Oxoid公司产品;DNA分子量标准、聚合酶链反应(PCR)反应试剂,购自TaKaRa公司;细菌染色体DNA提取试剂盒WizardgenomicDNApreparationkit,为Promega公司产品。

1.2方法

1.2.1MRSA的检测采用K—B纸片扩散法。根据2005年版美国临床实验室标准化研究所(CLSI/NCCLS)M100—S15文件推荐的方法进行操作和判读结果,即采用OXA(1μg)或FOX(30μg)纸片、M—H琼脂35℃培养24h,抑菌环直径≤10mm或19mm时,判定为MRSA阳性株。

1.2.2药敏试验采用K—B法及E—test试条进行药物敏感性判定及MICs值检测。药敏结果根据2005年版CLSIM100—S15文件推荐的标准进行判读。

1.2.3菌株染色体DNA的提取采用WizardgenomicDNApreparationkit提取金黄色葡萄球菌染色体DNA;细菌裂解步骤反应体系中另加入葡萄球菌溶菌酶0.5μg/mL和RNase0.3μg/mL。

1.2.4多重PCR扩增[4]反应体积为50μL,含1×PCR反应缓冲液,1.5mmol/LMg2+,200mmol/LdNTPs,引物各0.4μmol/L,Tap酶1.25U,DNA模板约10ng;反应参数:94℃预变性4min,94℃40s,53℃40s,72℃1min,循环35次,最后72℃延伸4min。

1.2.5PCR产物分析采用琼脂糖凝胶电泳法,以DNA分子量MarkerDL2000为分子量标准,在含0.5μg/mL溴乙锭的1.5%琼脂糖凝胶中电泳后,用凝胶成像系统观察结果并照相。

1.2.6统计学分析采用χ2检验进行样本率的比较。

2结果

2.1MRSA检出率126株受试菌中,分离自痰液88株(69.84%),血液13株(10.32%),脓性分泌物21株(16.67%),腹水4株(3.17%)。其中43株鉴定为MRSA(34.13%)。广州、深圳和湖南省部分地区来源的菌株,MRSA检出率分别为32.61%(15/46)、37.93%(22/58)和27.27%(6/22),差异无显著性(χ2=0.88,P=0.64)。

2.2SCCmec基因分型采用多重PCR技术对SCCmec进行基因分型,I型可见495bp、342bp、162bp三条PCR产物带;III型可见303bp、243bp、162bp三条PCR产物带;IIIa型可见243bp、162bp二条PCR产物带。43株MRSA中,24株(55.81%)为III型;11株(25.58%)为IIIa型;3株(6.98%)为I型;5株(11.63%)不能识别,为未定型。

2.3SCCmec基因型及其耐药率SCCmec基因I型的MRSA100.00%(3/3)对青霉素和苯唑西林耐药,33.33%(1/3)对四环素耐药,对其他种类的抗菌药物较为敏感。SCCmec基因III型和IIIa型的MRSA具有对临床常用抗菌药物的多重耐药性,对红霉素、庆大霉素、克林霉素、利福平和环丙沙星的耐药率明显高于SCCmec基因I型菌(P<0.05),但对万古霉素、氯霉素和复方磺胺甲口恶唑较为敏感。

3讨论

随着广谱抗生素的大量使用，近20年来由革兰阳性细菌引起的感染有上升趋势，而在革兰阳性菌中MRSA的感染日益增多，已成为医院感染的重要病原菌之一，感染多见于有严重基础疾病、免疫功能低下，并使用侵入性操作和广谱抗生素者［5］。自Jevons首次报道SA的MRSA菌株以来,其检出率呈逐年上升态势,是目前医院内感染最棘手的病原菌之一。MRSA成为多重耐药性SA的代名字。虽然各地报道的MRSA检出率不一,但从临床上分离到的SA,耐青霉素和其他β-内酰胺类抗生素率高达60%以上,有90%的菌株存在耐药基因［5］。然而,在日常生活中SA是一种人体局部的正常菌群,携带SA一般不会致病,更不会出现不易治愈的实例。

MRSA的耐药基因主要定位于SCCmec基因盒上,MRSA是金黄色葡萄球菌获得甲氧西林抗性决定子-mecA基因后产生的一种高耐药性菌株。MRSA耐药谱广、耐药性强,给临床治疗带来了巨大的困难,已成为全世界多学科研究的热点问题。

本研究结果表明,MRSA的SCCmec基因型以III型或IIIa型为主,具有多重耐药的特征,但对万古霉素、氯霉素和复方磺胺甲口恶唑较为敏感。其结果有助于指导临床合理使用抗菌药物,并部分阐述了其多重耐药性产生的分子机制。

参考文献

[1]CoutoI,Melo-CristinoJ,FemandesML,eta.lUnusallylargenumberofmethici-llin-resistantStaphylococcusaureusclonesinaPortuguesehospital[J].JClinMicrobio,l1995,33:2032.

[2]陈民钧.细菌耐药性的增长与对策[J].中华医学检验杂志,1997,20(5):263.

[3]ChongtrakoolP,ItoT,MaXX,etal.Staphylococcalcassettechromosomemec(SCCmec)typingofmethicillinresistantStaphylococcusaureusstrainsisolatedin11Asiancountries:aproposalforanewnomenclatureforSCCmecelements[J].AntimicrobAgentsChemother,2006,50(3):1001-1012.

[4]OliveiraDC,LencastreHD.MultiplexPCRstrategyforrapididentificationofstructuraltypesandvariantsofthemecelementinmethicillinresistantStaphylococcusaureus[J].AntimicrobAgentsChemother,2002,46(7):2155-2161.

[5]王丽春，李大江，熊中华，等.金黄色葡萄球菌医院感染的临床及耐药性分析[J].中华医院感染学杂志，2008，18（10）：1485-1488.

[6]PanliloAL,CulverDH,GaynesRP,eta.lMethicillin-resistantstaphylococcusaureusinUShospitals1975-1991[J].InfectionControlandHospitalEp-idemiology,1992,13:582.