乳腺癌微卫星不稳定及细胞杂合性缺失的研究

乳腺癌微卫星不稳定及细胞杂合性缺失的研究

肖飞宋亚锋

（湖北武汉市普爱医院胃肠甲乳外科430030）

【摘要】目的:探讨微卫星不稳定性（MSI）和3号染色体在乳腺癌发生中的作用及病理学意义。方法：对41例乳腺癌和13例癌前病变患者资料进行分析，采用PCR-SSLP应急银染法检测患者中,MSI状态应急3P上卫星位点LOH发生情况，采用免疫组化SP方法检测错配修复上相关基因的表达情况。结果：15例出现2个及以上位点不稳定，5例出现5个位点阳性；12个位点的MSI发生率为0%-31.7%。13例癌前病变患者中，9例不稳定，其中2例MSI+阳性率为15.4%。41例乳腺癌患者中，LOH阳性率为97%，显著高于乳腺良性患者的41.7%（P<0.05）。结论：乳腺癌患者中错配修复基因表达发生缺陷以及MSI在乳腺癌发生、发展中发展重要作用；3P最小共同缺损区主要位于3P14-p25能够影响患者生物学行为。

【关键词】微卫星不稳定性；3号染色体；乳腺癌；病理学意义

为了探讨微卫星不稳定性（MSI）和3号染色体在乳腺癌发生中的作用及病理学意义，现选取2013年4月-2014年4月我院收治的41例乳腺癌和13例癌前病变患者资料进行分析，报告如下。

1.资料与方法

1.1一般资料

入选患者均经过手术病理确诊，手术切除后将新鲜的标本立即保存着在温度为-80℃的低温冰箱中。乳腺患者均为女性，年龄为32.8～76.9岁，平均（55.7±3.1）岁。35例浸润性导管癌，2例浸润性小叶癌，3例髓样癌，1例富于脂质癌。13例良性增生患者中，9例导管内乳头状瘤变，4例不典型增生。

1.2方法

采用PCR-SSLP应急银染法检测患者中,MSI状态应急3P上卫星位点LOH发生情况，采用免疫组化SP方法检测错配修复上相关基因的表达情况，方法如下：（1）DNA提取。取上述患者0.5g新鲜组织将其防止在液氮中研磨，称取20g/l蛋白酶K消化，酚-氯仿提取，然后检测DNA浓度，并将其放置在温度为-20℃下保存。取8-10片石蜡组织切片，在脱蜡后加入无水乙醇洗脱，并采用蛋白酶K消化、酚-氯仿提取，然后检测DNA浓度，并将其放置在温度为-20℃下保存。（2）微卫星引物。选用12个微卫星位点以及3号染色体短臂11个位点。引物主要来源于GenBank和GDB。（3）聚合酶链式反应-单链长度多态性。研究中，PCR体积为25ul，引起分别为150nmol/l，0.2ulTaq酶，1.5ul模板DNA。反应结束后对部分产物进行电泳，观察扩增效果，然后加入8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，并进行染色，观察结果。（4）免疫组化学染色。采用SP法对每一批标本进行染色，设置阳性对照和阴性对照[1]。

1.3判断标准

MSI和LOH判定：和正常组织相比，如果被测组织等位基因出现条带数目变化或位置迁移则为MSI；若某一条等位基因带消失或相对密度减少50%以上为LOH[2]。

免疫组织化学结果的判定：hMLH1和hMSH2蛋白主要定位于胞核，偶见胞浆和胞膜。ER、PR阳性判断标准：阳性表达定位于胞核或胞浆着色。

1.4统计学方法

利用SPSS18.0软件进行处理，其中符合正态分布的数据进行单因素方差分析，存在统计学意义予以LSD法两两比较。P<0.05为组间差异有显著性。

2.结果

2.1乳腺不同病变中MSI检测情况

本次研究中，MSI阳性图像在乳腺癌和癌前病变中以条带增加为主，减少和移位相对较少，而良性增生中无MSI存在，微卫星不稳定病例的代表图像（见图1）。

图1乳腺癌组织和癌前病变组织的MsI图像

图11a和1b为乳腺癌组织；1c和1d为癌前病变组织；蓝色为正常组织；红色为乳腺组织。

41例乳腺癌患者中，15例出现2个及以上位点不稳定，5例出现5个位点阳性；12个位点的MSI发生率为0%-31.7%。其中，D3s1766、D2S2739和TP5位点阳性率较高，分别为31.7%、19.5%和14.6%。13例癌前病变患者中，9例不稳定，其中两例MSI+阳性率为15.4%。

2.23P各微卫星位点LoH检出率

本次研究中，41例乳腺癌患者中LOH阳性率为97%（20例），显著高于乳腺良性患者41.7%（5例）（P<0.05）。11个微卫星中，乳腺癌LOH检出率分别为：D3s1295(53.1%)、D3S1029(43.6%)、D3S1038(52.5%)；癌前病变LOH检出率较高的为27.3%的D3s1295以及16.7%的D3S1029。见图2。

图23p微卫星位点不同类型电泳图

3.讨论

本文选择位于6条染色体上包括单、2、3、4核苷酸重复序列的12个位点进行研究，实验结果显示：乳腺癌SI阳性率为36.6%。由此说明：MSI在乳腺癌中属于是一种常见的现象。同时，微卫星异常主要分布在D3S1766、D2S273M9以及TP53等三个位点，同样的现象还出现在17号染色体，提示：乳腺癌中可能存在其特有的MSI热点或热点染色体区段，并且患者机体内基因异常导致肿瘤形成具有器官的特异性。MSI通常时由于错配修复等基因发生突变、缺失或启动子甲基等引起。并且，3号染色体短臂等位基因缺失在许多肿瘤中均有表达。本研究中，41例乳腺癌患者中LOH阳性率为97%（20例），显著高于乳腺良性患者41.7%（5例）（P<0.05）。提示：该基因是影响其担保在乳腺癌表达中的重要因素，它能够影响乳腺癌发生、发生及生物学行为，但是它并不会影响蛋白的表达。

综上所述，乳腺癌患者中错配修复基因表达发生缺陷以及MSI在乳腺癌发生、发展中发展重要作用；3P最小共同缺损区主要位于3P14-p25能够影响患者生物学行为。

【参考文献】

[1]曾华，丁伟斌，赵毅，等.放疗后复发鼻咽癌微卫星不稳定和杂合性缺失改变的研究[J].广东医学院学报，2014，32(3):282-286.

[2]李化梅，李龙萍，苏俊，等．B细胞淋巴瘤bcl-2基因重排与14号染色体微卫星改变的研究［J/CD］．中华临床医师杂志:电子版，2013，7(10):4217-4220．