幽门螺杆菌的脂多糖结构和生物合成

幽门螺杆菌的脂多糖结构和生物合成

罗敏菱（译）

（四川省第五人民医院四川成都610031）

【摘要】本综述涉及幽门螺杆菌脂多糖（LPS）结构和生物合成的现有知识和分歧。幽门螺杆菌是一种革兰氏阴性菌，定植于人类胃黏膜上皮细胞的管腔面。脂质A构成改变阻碍TLR4诱导以及幽门螺杆菌LPS通过以Lewis抗原修饰O抗原来模仿宿主,都促进了免疫逃逸和慢性炎症。至今，尚未获得幽门螺杆菌LPS的完整结构，目前推荐的模型为一种线性结构，其内核由被定义为多聚己糖（Kdo-LD-Hep-LD-Hep-DD-Hep-Gal-Glc）的物质构成的，外核由保守的三糖（-GlcNAc-Fuc-DD-Hep-）组成，连接到由Lewis抗原修饰的多聚LacNAc构成的内核、葡聚糖、庚烷和一个可变O抗原的第三个庚糖上。虽然负责幽门螺杆菌O抗原链合成的糖基转移酶已经被识别和描述，但是在有关核心LPS的合成方面仍存在许多分歧。这些局限性保证了对该胃内细菌会有的足够的诱变和结构方面研究，从而获得其完整LPS结构和相关生物合成路径。

【关键词】幽门螺杆菌；脂多糖结构；生物合成

【中图分类号】R37【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2016）17-0233-07

脂多糖（LPS）是一种大的、可变的复杂糖脂，也是革兰氏阴性菌外膜的结构的组成成分。位于外膜（磷脂双分子层）的外层，LPS分子维持着外膜的屏障功能，并介导细菌之间以及细菌和环境之间的一些相互作用。

到目前为止，幽门螺杆菌LPS的推荐结构（图1）与其他革兰氏阴性菌脂多糖分子遵循相同的基本结构。它由三个结构域组成：一个嵌入外膜内的疏水结构域，被称作脂质A（或称内毒素）；一个相对保守的非重复核心寡糖；以及最外层可变的多糖（或称O抗原）。

LPS的这三个结构域的结构差异赋予了它们不同的生物学特性：脂质A结构域与免疫受体相互作用并使脂多糖分子具有一系列免疫学和潜在内毒素特性；核心寡糖则影响外膜的通透性；而O抗原则决定了脂多糖分子的抗原性和血清特异性。

幽门螺杆菌是一种螺旋形微需氧革兰氏阴性菌，一般定植在人体内，且在某些国家的流行率高达90%。幽门螺杆菌极好的适应了人类的胃黏膜（环境），在缺乏抗生素治疗的情况下其可在一个胃小凹中存活数十年。幽门螺杆菌LPS的结构特点赋予其两种主要的持续存在机制：（1）Lewis抗原对O抗原的修饰促进了其对宿主的模拟，从而易化了免疫逃逸；（2）独特的结构脂质A核心使其能耐受宿主的阳离子抗微生物肽（CAMPs）。因此，对幽门螺杆菌LPS生物合成路径的研究代表向更好的理解细菌的宿主适应性、识别新的治疗靶点找到根除方法迈出了重要一步。

自首次报道从NCTC11637菌株中纯化得到幽门螺杆菌的LPS结构以来，大量基因的、生物化学的和结构的研究已被实施，阐释了LPS合成路径且进一步描述了其结构特点。值得注意的是，幽门螺杆菌LPS生物合成研究的一个困难在于已知的、与LPS生物合成的有关基因分散在幽门螺杆菌的整个基因组中，而不是像通常其他的革兰氏阴性菌那样组成一个操纵子。此外，尝试生产基因HP0279敲除（编码使LD-Hep转化为Kdo肝转移酶Ⅰ）的突变体没有获得成功，提示幽门螺杆菌中最小的LPS结构除了脂质A和Kdo外可能还需要一个Hep结构。这与大肠埃希菌形成了对比——最小脂多糖结构改变仅需要脂质A和Kdo。

至今，幽门螺杆菌中参与脂质A和O抗原生物合成的大多数酶已经被识别和描述。然而，负责脂多糖核心区生物合成的酶仍未被识别。对于孤立菌株26695、SSI和血清组O:3幽门螺杆菌LPS核心区的早期研究假设核心区是一种分支结构。然而，近期的重新调查推翻了这种结构并且证实在这些菌株中（脂多糖核心区）是一种线性核心结构。其中最有趣的是，最接近外核一种新的三糖成分GlcNAc-Fuc-DD-Hep，已被证实在这三种菌株中都是保守的。

这篇综述总结了有关幽门螺杆菌LPS生物合成酶及路径的现有知识，并考虑到近期重新调查的从菌株26695获得的LPS结构的数据（图1）。

图1推荐的幽门螺杆菌参考菌株26695的LPS结构。推荐的完整模型基于幽门螺杆菌LPS结构的重新调查。LPS的三个结构域已被识别：脂质A，核心寡糖（进一步分为内核和外核）以及O抗原。

1.脂质A的结构和其生物合成作用

脂质A又被称为内毒素。它可被宿主血清中的LPS结合蛋白（LBP）探查到，这依赖于分化辅助因子14（CD14）和骨髓分化因子2（MD2），然后被调理素受体CD14识别，形成一个三元复合物，随后这个复合物激活Toll样受体4（TLR4），从而引发信号级联反应，导致细胞因子、凝血因子的产生以及CAMPs和其他刺激性分子的分泌。CAMPs通过与带负电的结构模体（如：脂质A的磷酸基团）结合来帮助明确入侵的病原体，最终导致细胞的裂解和死亡。然而，如果免疫应答过强，就可能发生脓毒症或感染性休克，导致多器官功能障碍综合征和死亡。

既往报告已表明TLR4也是幽门螺杆菌LPS的一种受体。Cullen等人报道称，与大肠埃希菌的LPS相比，幽门螺杆菌需要更高浓度的LPS活化TLR4，这是由于一些酶对幽门螺杆菌LPS的构型修饰。当修饰酶突变失活，幽门螺杆菌的LPS就形成一种六酰化、双磷酸化脂质A，可强力激活TLR4。Cullen等人还报告了幽门螺杆菌LPS即使在10000ng/ml的高浓度也不能活化TLR2,数据可信。相比之下，其他报告通过观察牙龈卟啉单胞菌的LPS，指出幽门螺杆菌LPS的识别是由TLR2而不是TLR4介导的。这些发现之间的矛盾或许是由于LPS准备物被有脂蛋白激活活性的TLR2污染造成的。有趣的是，一个最近的研究指出TLR10也是参与幽门螺杆菌LPS识别的功能受体。

与其他的肠杆菌科的脂质A相比，幽门螺杆菌脂质A激活TLR4的作用更弱、内毒素的毒性也仅为其他的肠杆菌科的千分之一。这种对TLR4弱诱导作用的分子基础是脂质A通过低水平磷酸化和一种罕见的酰化模式与酰基链长度所形成的修饰。在大肠埃希菌、脑膜炎奈瑟菌和铜绿假单胞菌中，脂质A的结构包涵6个14或12碳脂质分子，并且在1位与4’位上带有2个磷酸基。这些特征通常被认为最有利于诱导TLR4介导的炎症反应最大化。然而，幽门螺杆菌脂质A最主要的化学种类是一个β-1,6-D-葡糖胺双糖骨架，被4个而不是6个长链脂肪酸（两个18碳和两个16碳脂质分子）酰化，缺少常见的4’位磷酸基，并且1位上的磷酸基被PEtN基团取代（图1）。

2.幽门螺杆菌脂质A的组装

脂质A的生物合成在革兰氏阴性菌中十分保守，且发生在内膜胞浆层上，通过一个九步的生物合成路径——Raetz路径（包含8种Lpx酶和一种Kdo糖基转移酶）进行（图2）。

图2提出的在幽门螺旋杆菌中的Kdo2-脂质A生物合成通路依据最近一项回顾和幽门螺旋杆菌中脂多糖生物合成通路KEGG，幽门螺旋杆菌中Kdo2-脂质A被指出通过一个九步酶通路产生（8种Lpx酶和1种Kdo糖基转移酶）。第一步：通过LpxA（HP1375）添加酰基链到UDP-GlcNAc；第二步：通过LpxC（HP1052）把乙酰基从UDP-3-O-acyl-GlcNAc移除；第三步：通过LpxD（HP0196）添加第二个酰基链；第四步：通过LpxH解开焦磷酸键，生成脂质X；第五步：通过LpxB(HP0867)缩合脂质X和UDP-2,3-diacyl-GlcN，生成独特的4-酰基-双糖-1-磷酸；第六步：通过激酶LpxK(HP0328)在4’-位置磷酸化，生成脂质IVA；第七步：通过双功能KdtA(HP0957)添加2个Kdo组成Kdo2-IVA；第八步：通过LpxL(HP0280)添加第二个酰基链到2’-位置；第九步：通过LpxM添加另一个酰基链到3’-位置（幽门螺旋杆菌中同源物未证实）。

在幽门螺杆菌中，除了LpxM和Kdo转移酶，京都基因和基因组数据库百科全书（KEGG）包括七种Lpx蛋白的同源物。幽门螺杆菌中，认为九步的Kdo2-脂质A生物合成过程起始于UDP-GlcNAc（图2）。第一步是被LpxA催化，在UDP-GlcNAc添加上一条酰基链，形成UDP-3-O-酰基-GlcNAc。第二步是被LpxC催化，从UDP-3-O-酰基-GlcNAc去掉乙酰基，生成UDP-3-O-酰基-GlcN。第三步中LpxD在第二位上添加一条酰基链生成UDP-2，3-二酰基-GlcN。第四步中，部分LpxD产物的焦磷酸键被LpxE切断，生成脂质X（2，3-二酰基-GlcN-1P）。第五步中，脂质X和UDP-2，3-二酰基-GlcN被LpxB压缩从而产生具有β-1,6-连接GlcN双糖骨架特点的脂质A。第六步由一种特殊的激酶LpxK催化，产生脂质ⅣA。在第七步中，双功能Kdo转移酶（HP0957）（也被称为WaaA或KdtA）负责将两个阴离子8碳Kdo糖从糖基供体CMP-Kdo转化成脂质ⅣA，生成Kdo2-ⅣA。最后两步由乙酰转移酶LpxL和LpxM催化，添加两个2位的酰基链到Kdo2-ⅣA的远端GlcN单位上，生成六酰Kdo2-ⅣA。

基于KEGG幽门螺杆菌LPS的生物合成和磷酸戊糖途径，总结了能激活糖UDP-GlcNAc和CMP-Kdo的两个核苷酸产生的生物合成路径（分别为图S1和图S2）。

3.幽门螺杆菌脂质A的构成修饰

幽门螺杆菌脂质A的构成修饰是结构性的，这比较罕见，因为大多数细菌脂质A的修饰都基于环境信号。幽门螺杆菌这种脂质A的修饰是由免疫系统的低水平诱导造成的，这也是幽门螺杆菌逃避先天性免疫的重要机制，由此幽门螺杆菌可导致慢性炎症。这些修饰可能是幽门螺杆菌与人类长期共同进化的结果，至少可以追溯到60000年前他们共同从非洲外迁。

图3幽门螺旋杆菌中基本的脂质A修饰通路幽门螺旋杆菌通过一个5步酶通路生成高度修饰的脂质A。第一步：通过LpxE(HP0021)解开Kdo2-脂质A的1-磷酸基团；第二步：通过EptA(HP0022)在1-位置添加PEtN；第三步：KdoH1(HP0579)和KdoH2(HP0580)移除末端Kdo糖；第四步：通过LpxF(HP1580)移除4’-磷酸基团，留下未修饰的羟基；第五步：通过LpxR(HP0694)移除3-O-连接酰基链，生成4-酰基化脂质A。前4个修饰反应发生在内膜质周小叶。最后一步发生在外膜。为简单起见，核心寡糖和O抗原未呈现。

幽门螺杆菌脂质A的修饰是高度有序和复杂的过程，通过一个五步的酶促反应进行（图3）。首先，Kdo2-脂质A的1位磷酸基被LpxE去掉，随后由EptA添加一个PetN残基。接着，Kdo水解酶去掉末端的Kdo糖，随后第二个磷酸酶LpxF去掉4’位磷酸基。最终的修饰发生在外膜，LpxR去掉2个3-O-连接酰基链，形成一个四酰化脂质A。所有参与这些步骤的酶都已被识别和描述。现已证实HP0579-0580（编码Kdo水解酶）突变可使幽门螺杆菌对多粘菌素B的敏感性提高180倍以上，这是下游修饰中脂质A的4磷酸基缺陷产生的结果。lpxE，lpxF或lpxE/F的缺失突变使幽门螺杆菌对多粘菌素B和许多其他天然产生的CAMPs的敏感性分别提高16倍，360倍和1020倍，并且对TLR4的敏感性分别提高2倍，6倍和10倍。有趣的是，lpxE/F突变使幽门螺杆菌丧失了在小鼠胃内的定植能力，证明了幽门螺杆菌LPS脂质A结构域去磷酸化的重要作用。

4.核心寡糖的结构和生物学作用

位于脂质A和O抗原之间的脂多糖中心区域的核心寡糖，可以进一步划分为两个部分，即内核和外核（图1）。在一个菌属中，内核的结构趋向于保守，而来自关系疏远的细菌的核心寡糖共享内核结构特点，这是脂多糖核心在外膜完整性中重要性的反映。典型内核包括两个LD-Hep残基，命名为HepI和HepII。

在大肠杆菌中，内核HepI通过WaaP激酶被PetN残基修饰，而HepII被另一个DD-Hep残基（HepⅢ）和磷酸（P）修饰，分别被WaaQ激酶和WaaY激酶催化（图4）。在这些活动中，WaaP酶具有最重要的作用，因为这些修饰必须按照WaaP→WaaQ→WaaY的严格顺序进行。WaaP的缺失会造成突变，表达的脂多糖完全为碳水化合物载体并且像亲代菌株一样生长；然而，它对疏水化合物敏感性明显增加，像深粗糙菌株（deeproughstain？strain）一样无毒。后来证明通过WaaG突变导致的超出HepII残基LPS的截断，也导致对疏水化合物敏感性增加，且证实对内核磷酸化有直接的影响：WaaP外核缺失可导致低效磷酸化（野生型水平的40%）。在革兰氏阴性菌中，具有最多的磷酸化的内核（图4）。从未被分离或构造出缺少内核Hep或磷酸基团的突变体，暗示着Hep相关磷酸基团对于铜绿假单胞菌的生存能力至关重要。添加了带负电荷磷酸基团的内核使邻近的LPS分子能够通过二价阳离子比如Ca2+，Mg2+交联，从而稳定了外膜。

大肠杆菌和铜绿假单胞菌的内核带有明显的负电荷，而幽门螺旋杆菌为了减少内核负电荷而进化了修饰，包括：（1）HepII没有被磷酸根修饰；（2）外Kdo负电荷被Kdo水解酶去除。只有HepI被PEtN修饰，意味着可被HP1417转移。另外，HepⅢ是在细菌中相对少见的DD-Hep，可以被分支二糖Gal-Glc替换（图4）。

图4大肠杆菌、铜绿假单胞菌和幽门螺旋杆菌中LPS内核结构。在大肠杆菌中，内HepI通过WaaP激酶被PEtN修饰；添加了一个HepⅢ并且被一个磷酸残基修饰，分别通过WaaQ和WaaY激酶作用。铜绿假单胞菌在革兰氏阴性菌中具有最磷酸化的内核：HepI被3个磷酸残基和1个PEtN修饰，HepII被3个磷酸残基和1个氨基甲酰基（Cm）修饰。相反，在幽门螺旋杆菌中内核缺乏磷酸残基，KdoII通过Kdo水解酶去除，HepI被PEtN修饰（HP1417被预测为PEtN转移酶）。从简起见，外核和O抗原未阐述。

幽门螺旋杆菌外核在菌属中表现出一定程度的变异。幽门螺旋杆菌外核独特特点之一是同聚体的出现。在菌株26695中可识别出DD-庚烷（包括DD-Hep）和α-1,6-葡聚糖（包括Glc）。其他分离出的临床菌株中也存在DD-庚烷（图5,6,7）。最近，在菌株SS1外核中发现另一同聚体β-1,2-核糖（包括3-5β-呋喃核糖）（图5）。据报道，从Danish菌株（D10）、NCTC菌株11637和两个临床菌株中分离出的LPS中除了DD-庚烷、α-1,6-葡聚糖和β-1,2-核糖，也存在同聚体α-1,4-葡聚糖。

图5幽门螺旋杆菌26695，SS1和血清组O：3菌株中LPS外核结构。幽门螺旋杆菌26695菌株（A）外核依据参考；SS1菌株（A）依据参考；O：3（A）依据参考；O：3（B）依据参考；26695(B)，SS1(B)andO:3(C)依据这三株菌株的再研究；(m=4,，n=3在菌株26695B中)；(n=3–5在菌株SS1(B)中)；(m=5–6，n=2–3在O:3(A)菌株中)；m和n在其他结构中为呈现于书面。从简起见，脂质A、内核、O抗原未阐述。

图6在其他幽门螺旋杆菌中LPS外核结构。幽门螺旋杆菌J99株中外核依据参考；菌株11637(O:1)/P466/H428/H507/UA915/UA948/UA955/J223/CA2/CA4/CA5/CA6/F-58C/F-15A/R-58A/F-58C/GU2/R-7A/H607依据,n=2-3；PJ1菌株依据参考，m=5，n（庚烷）=2，n（葡聚糖）=2-3。从简起见，脂质A，内核，O抗原未阐述。

图7不同临床幽门螺杆菌菌株的脂多糖外核结构。幽门螺杆菌菌株结1C2，12C2，62C，7A,75A和77C的结构基于参考文献。*表明这些庚烷同聚体都由不完整的Lewis抗原（FUC，GlcNAc）封闭，n=4–5。丹麦菌株D2，D4，D4是基于参考文献；所有这些菌株都缺乏典型的Lewis抗原。为了简化起见，内芯和脂质A均未表示。

最初推测幽门螺旋杆菌26695菌株的LPS外核结构为庚烷第一个DD-Hep包含一个可替换的α-1,6-葡聚糖侧枝。然而，关于26695LPS的新近研究揭示α-1,6-葡聚糖与三糖元素GlcNAc-Fuc-DD-Hep中的DD-Hep残基直接相关。幽门螺旋杆菌SS1和O：3菌株中也可发现这个三糖元素。非常有趣的是，复查26695LPS结构的发现庚烷与葡聚糖直接相关，使得LPS几乎完全为线性结构，HepIII中的Gal-Glc二糖除外（图1）。

幽门螺旋杆菌LPS的核心寡糖有助于研究细菌发病机制和定植。内核涉及到与基底层细胞外基质糖蛋白-层粘连蛋白的结合。这种结合抑制表皮细胞受体（整合蛋白）对层粘连蛋白的识别，破坏了胃粘膜的完整性。这种结合也刺激胃蛋白酶原的分泌，导致腔面粘膜层的腐蚀。关于外核作用，已表明α-1,6-葡聚糖与宿主最初定植有关。最初定植并不需要DD-庚烷，它可增加LPS的长度和灵活度，从而覆盖在细菌表面，干扰细菌毒素与宿主细胞上皮的相互作用。该理论的基础为，大多数表达庚烷但是缺乏Lewis抗原的临床菌株是从无症状性宿主中分离出的。新型的D-半乳聚糖和扩展的β-1,2-核糖在缺乏O抗原的突变的沙鼠传代菌株（SS1HP0826::kan）中的出现支持这一观点。

5.LPS内外核的整合

碳水化合物Kdo是脂质A与内核Hep残基的连接部分，具有被Gal和Glc修饰的HepIII（图3）。HepI被HepI转移酶RfaC（HP0279）转移到Kdo。然后，HepII被RfaF（HP1191）转移到HepI。最初推测HP0479为HepⅢ转移酶；然而，后来的大量光谱测定分析发现它涉及外核的整合，因此，尚未确认负责HepⅢ添加的酶。另外，连接Gal残基和HepⅢ上双糖分支的糖基转移酶也尚未被证实。分支双糖的Glc残基被发现可通过HP1416转移。HepI和HepII的供体是ADP-LD-Hep，而HepⅢ的供体是ADPDD-Hep。ADP-LD-Hep和ADP-DD-Hep产生的生物合成通路是从Glc开始的（图S3）。需要注意的是，所有涉及D-sedo-heptulose-7P中ADP-LD-Hep合成的基因在基因组（HP0857到HP0860）中簇集到一起。最后一个基因ADP-LD-Hep生物合成所需的rfaD（HP0859）的断裂，被证实会导致严重的LPS截尾，降低生长速率，对新生霉素有更敏感，降低与AGS细胞的粘附，诱导AGS细胞中“鸟鸣”表型失败，暗示着LPS与IV型分泌系统（T4SS）之间存在联系。Hep-lessrfaD突变体的生存表明幽门螺旋杆菌脂多糖结构中没有任何Hep残基也能够存活。然而，这项研究难以调节转移Hep1到脂多糖内核的HP0279突变体的死亡率。最终，UDP-Gal和UDP-Glc作为分别附加于HepIII上的Gal和Glc残基的糖基供体，也是由Glc生成的（图S4）。

外核起始于附加于HepIII的保守的三糖GlcNAc-Fuc-DD-Hep。前两个碳水化合物基团转移所需要的GTs尚未证实，而负责DD-Hep转移的酶被发现为HP0479，它是幽门螺旋杆菌中第一个被证实的DD-Hep转移酶。邻近三糖的是α-1,6-葡聚糖，紧跟着一个α-1,3-庚烷。经证实负责葡聚糖添加的酶为HP0159，但转移庚烷的酶尚未证实。Fuc供体是GDP-L-Fuc，通过以细节为突出特点的denovo通路和一条补救通路产生，循环利用宿主中L-Fuc。补救通路仍然在研究中，因为Fuc激酶和GDP-Fuc焦磷酸化酶尚未得到证实（图S5）。

核心寡糖的碳水化合物依次附加于组成脂质A核心的内膜胞浆小叶上的Kdo2-脂质A。然后，这个分子通过内膜质周小叶的MsbA翻转酶翻过内膜，随后在质周间隙与O抗原接合（图8）。

图8O抗原的组装及其与幽门螺杆菌脂质A核心的连接组件。幽门螺杆菌O抗原的组装及其与脂质A核心的连接组件要求有三个内部膜结合酶：WecA（hp1581）、Wzk（hp1206）和WaaL（hp1039）。WecA启动O抗原的组装，通过将GlcNAc转移到Und-PP载体形成Und-PP-GlcNAc。随后，胞质中的GTs包括hp1105，hp0826，FutA和FutC，添加相应的糖形成O抗原，在翻转酶wzk的催化下，O抗原被翻转到周质。脂质A核心也是在细胞质中组装，被翻转酶MsbA（hp1082）翻转到周质，在那里O抗原与脂质A核心在O抗原连接酶WaaL作用下，形成完整的幽门螺杆菌LPS。

6.O抗原的结构和生物作用

幽门螺杆菌菌株的O抗原通常包括一个Gal-GlcNAc（半乳糖葡萄糖）主链，根据连接方式不同可以分为两种类型。1型链由Gal-（β-1,3）-GlcNAc组成，产生了Lewisa(Lea),Lewisb(Leb),Lewisc(Lec),Lewisd(Led或H-1)和sialyl-Lea。2型链由Gal-(β-1,4)-GlcNAc(LacNAc)组成，产生了Lewisx(Lex),Lewisy(Ley)和sialyl-Lex(图9)。基于抗-Le抗体探针在全球范围不同地区的筛查结果，2型Lex和Ley绝大多数（80-90%）在幽门螺杆菌菌株中表达。也有人提出，1型Lea和Leb主要在亚洲宿主中表达。有趣的是，幽门螺杆菌同时表达1型和2型抗原，这在亚洲和西方人群中是一致的。这些研究结果表明，在同一菌株或携带不同菌株的同一宿主中出现了1型和2型抗原的镶嵌式表达（马赛克表达）。

一些典型菌株被可抗Le抗体识别，但有些菌株没有反应。Lewis抗原反应性缺乏可能导致这些研究中使用的血清学检测结果假阴性。例如，临床菌株AF1和007血清学检测无法分型，而质谱结构分析表明，每个菌株有一个高岩藻糖基化程度位点，生产聚合物内部Lex链，连锁终止于Lex和Ley。这表明：血清学分析可能低估了Lex和Ley的表达。换句话说，某些菌株确实缺失Lewis抗原，携带其他新型链，包括三糖重复单元3-C-甲基-D-甘露糖-（α-1,3-L—鼠李糖-（a1,3）-D-鼠李糖（在丹麦菌株D1，D3和D6中发现）。

图9幽门螺杆菌Lewis抗原的结构。幽门螺杆菌菌株的O抗原包括一个Gal-GlcNAc（半乳糖葡萄糖）主链，根据连接方式不同可以分为两种类型。1型链由Gal-（β-1,3）-GlcNAc组成，产生了Lea,Leb,Lec（也被认为是1型前体）,Led（也被认为是H-1)和sialyl-Lea。2型链由Gal-(β-1,4)-GlcNAc(LacNAc)组成，产生了Lex,Ley和sialyl-Lex。图中显示了连接方式和相应的GTs。

在人类胃内，Lea和Leb抗原主要是在胃窦部和胃体部的胃小凹表面上皮细胞顶端表达，而Lex和Ley主要是在胃窦部和胃体部的腺体上表达。胃细胞的Lewis抗原与幽门螺杆菌O抗原之间结构的相似性可能代表一种分子模仿或免疫耐受的形式，由于与“自身”抗原的相似性,可保护幽门螺杆菌LPS逃逸免疫识别。另一方面,这种相似性与自身免疫病的发病机制密切相关。具体而言，1型和2型的抗体与胃黏蛋白反应强烈，抗Lex靶细胞为多形核淋巴细胞（PMN），因其表面表达CD15（Lex），而胃质子泵（H+，K+ATPase）的β链被Ley糖基化，因此受到抗Ley抗体攻击。所有这些自身免疫反应导致了幽门螺杆菌相关萎缩性胃炎。Lewis抗原模仿机制可以保护幽门螺杆菌使其逃脱宿主的免疫监测，但是可以引发自身免疫性胃病，因而幽门螺杆菌被称为“披着羊皮的狼”。

研究已证明，Lex有助于幽门螺杆菌对胃粘膜的粘附，且糖蛋白半乳糖凝集素3是Lex的受体。与该重要作用相一致，小鼠适应菌株SS1主要表达Lex，也含有少量Ley的踪迹，报道称菌株J99，26695，和11–NCTC11637有类似的结果。值得注意的是，O抗原表达在不同的pH值下受表型变异限制（图10）。当26695菌株生长在pH值为7的流体介质中，大多数O链上的GlcNAc残基和Fuc（岩藻糖）残基发生糖基化，形成聚合的Lex，包括Lex单元进行链终止。而在pH值为5时，只有一些GlcNAc残基和Fuc（岩藻糖）残基发生糖基化，而大多数被Gal取代，链是由一个Ley单元终止的。由于胃中的pH值是变化的，从酸性pH值为2的黏膜层到几乎中性的上皮表面，幽门螺杆菌最佳的Lex表达部位为上皮细胞表面附近，从而促进幽门螺杆菌粘附。这些Lex表达减少的幽门螺杆菌可以停留在黏膜层，转化为自由游动的形式，作为后续感染的储备库。此外，Lex和Ley可以与树突状细胞C型凝集素DC-SIGN相互作用来阻碍辅助性T细胞（Th1）形成，从而下调炎症反应。其他与O链相互作用的C型凝集素是表面活性蛋白D（SP-D），这是在胃腔黏膜表面和由粘液分泌细胞组成的胃小凹中发现的。SP-D参与抗体依赖的病原体识别和清除过程，这已经表明，幽门螺杆菌的繁殖在SP-D-/-小鼠中更快速。

图11亲代菌株J178和SP-D逃逸变异（J178v）之间O抗原的结构变化。亲代菌株J178具有终端H-1单元，包含Lex，大多数的O链被Gal或Glc取代。然而，变异株j178vO链有更高层次的岩藻糖基化，仅有部分被Gal或Glc修饰，并由Ley终止。

筛查幽门螺杆菌SP-D来自母株J178的逃逸变异（j178v）表明，相变量futA基因在j178v中表达上调，这导致与添加半乳糖或葡萄糖相比，O链岩藻糖基化程度更高。相对于其对葡萄糖或半乳糖的亲和力，SP-D与Fuc具有低亲和力（图11），而futA基因在j178v中表达上调表避免了SP-D介导的清除。因此，具有更高程度岩藻糖基化的细菌在定殖过程中有选择优势。

7.O抗原的组装及其与脂质A核心的连接组件

O抗原的生物合成已知有三种途径：（1）Wzy依赖途径；（2）ABC转运蛋白依赖途径；和（3）合成酶依赖途径。前两个途径目前很常见，但合成酶依赖途径不太常见。三通路有类似的起始反应：形成十一异戊二烯焦磷酸（Und-PP）并连接糖，通常由WecA和GlcNAc-1P转运酶催化，形成Und-PP-GlcNAc。然而，三途径在O抗原聚合和易位反应方面有所不同。在Wzy依赖途径中，单个短的Und-PP连锁O抗原单元在细胞质中进行组装，然后通过Wzx翻转酶转运到外周胞质中，并在其中通过Wzx催化聚合，由Wzz调节最终的O抗原链长度。在ABC转运蛋白依赖途径中，整个O抗原是在细胞质中组装的，而后由Wzm和Wzt组成的ABC转运蛋白转运出去。Wzm形成膜通道，而Wzt提供了转运能量。第三路径依赖两种酶WbbE和WbbF，同时通过内膜延长并排出O抗原。

幽门螺杆菌O抗原的组装遵照新的wzk依赖途径（图8），与ABC转运蛋白依赖的途径在易位步骤有所不同。ABC转运蛋白依赖的途径在幽门螺杆菌O抗原易位反应中需要Wzm和Wzt，而幽门螺杆菌只需要蛋白Wzk。有趣的是，Wzk与以往任何已知的O抗原翻转酶无关，但是与空肠弯曲菌PglK是同源，空肠弯曲菌PglK负责翻转Und-PP-heptosaccharide从而使蛋白N-糖基化。研究证明，Wzk可在翻转Und-PP-heptosaccharide过程中恢复空肠弯曲菌的PglK突变体，提示LPS生物合成和蛋白N-糖基化之间的存在进化关联。

幽门螺杆菌O抗原的组装起始于WecA转运GlcNAc到Und-PP载体形成Und-PP-GlcNAc。随后，GlcNAc转运酶RfaJ(HP1105)和Gal转运酶(HP0826)分别添加GlcNAc和Gal形成LacNAc主链。然后，FutA（hp0379）将一个岩藻糖分子（通过α-1,3联动）选择性地连接到LacNAc主链的GlcNAc残基形成Lex。FutA和FutB在C末端区域的七肽重复序列的数目与岩藻糖基化的LacNAc主链上GlcNAc残基数目相对应，所以可作为酶的测量标尺。FutC（hp0093，0094）将一个Fuc残基转移（通过α-1,2联动）到末端Gal形成Ley。虽然已证实在幽门螺旋杆菌菌株p466中表达sialyl-Lex，同系物所需的a-2,2Neu5Ac转移酶尚未在幽门螺杆菌得到证实。Neu5Ac的糖基供体是CMP-Neu5Ac，HP0326编码CMP-Neu5Ac合成酶（图S6）。然而，尚未证实在幽门螺杆菌中存在参与CMP-Neu5Ac生物合成的其他酶同系物（图S6）。

图12参与幽门螺杆菌脂多糖生物合成的酶。基于文献资料，总结了幽门螺杆菌LPS的结构模型和生物合成。图中显示了LPS的三个域：脂质A，核心寡糖（进一步分为内核和外核），和O抗原。参与LPS生物合成途径已知的酶用蛋白质名称显示，而缺失的GTs用问号表示。n（heptan）=4，n（葡聚糖）=3

组装完转运到外周胞质后，O抗原与脂质A核心连接形成LPS分子的全长。值得注意的是，外芯的庚烷化后的GlcNAc残基已被推断为O抗原的锚点；然而，无论是结构或遗传方面，都没有实验数据可支持这一假设。因此，幽门螺杆菌LPS的核心和O抗原的精确定义有待实验研究。

尽管在幽门螺杆菌中LPS全长转运到外膜的机制有待阐释，但是在基因组中，LPS转运途径的同系物基因的存在，这表明：该细菌构成了LPS转运桥。

试图总结目前LPS结构和生物合成的知识，并且提出了一个建立在文献资料基础上的模型。在这个脂多糖模型中，脂质A、核心（内核和外核）和O抗原与幽门螺杆菌中参与LPS生物合成的蛋白质一同进行了阐释，而缺失的GTs则显示一个问号（图12）。

8.幽门螺旋杆菌LPS研究的未来方向

尽管幽门螺杆菌LPS结构里有特异性碳水化合物基团，与LPS组装相关的所有GTs，包括重要的三糖模块和核心LPS的第三个heptosyltransferase均尚未确定（图12）。研究幽门螺杆菌LPS生物合成的困难在于，到目前为止参与LPS生物合成的基因是分散在整个幽门螺杆菌基因组里的，而不是被存在一个操纵子中，在其他革兰氏阴性细菌中也通常是这种情况。因此，通过分子生物学、碳水化合物化学、对野生型和相关LPS突变体的结构进行分析，来确定幽门螺杆菌的总体结构与相关生物合成的途径。在撰写此文的同时，碳水化合物活性酶数据库（CAZy）已经阐释了幽门螺杆菌菌株基因组的48个测序，且每株超过20个ORFs（开放阅读框）（约占全基因组1～2%）已被标注为GTs（实验证实或假定的）。ORFs进一步分为12个GT家族，其中有几个假定的GTS以前没有研究过（总结见表1）。最后，对waaL突变体中累积的核心LPS的纯化及结构分析将会准确识别的幽门螺杆菌O抗原的锚点，以此来验证目前的LPS模型（图12）或重新定义幽门螺杆菌LPS的整体结构。尽管幽门螺杆菌LPS是定殖和持续存在的关键因素，LPS的结构和相应的生物合成途径仍有待充分阐释。建立这个重要的人类胃病原体的完整LPS结构是很关键的，将有助于更好的了解幽门螺杆菌的致病机制，如耐CAMPs和免疫逃逸机制，并可能带来新的治疗方案如靶向对抗LPS或涉及生物合成的相关酶。