一种细菌纤维素敷料的生物安全性评价

一种细菌纤维素敷料的生物安全性评价

黄丽娟

黄丽娟

天津中鼎生物医学科技有限公司天津300385

摘要：目的评价一种细菌纤维素敷料的生物安全性。方法利用自制的细菌纤维素敷料，通过动物实验和细胞实验，对敷料的生物安全性进行了评价。结果敷料浸提液的RGR为88.7%，细胞毒性反应为1级；敷料浸提液和溶剂对照平均记分之差均为0.0，未大于1.0；敷料生理盐水和芝麻油浸提液组动物皮肤反应等级未超过相应的阴性对照组动物反应等级。结论该细菌纤维素敷料的体外细胞毒性为1级，符合国家标准，无潜在皮内刺激作用和皮肤致敏性，具有较好的生物安全性。

细菌纤维素（Bacterialcellulose，BC）是由微生物发酵合成的多孔性网状纳米级生物高分子聚合物[1]。BC具有纯度高、优异的力学性能、良好的持水性能和亲水性、生物亲和性和生物相容性。正是这些优良的特性，预示了其广阔的用途，如伤口护理敷料、人造皮肤等[2]。

透明质酸钠是由N-乙酰氨基葡糖及D-葡糖醛酸双糖单位重复连接而成的高分子酸性粘多糖，广泛存在于动物和人体结缔组织细胞外基质中。透明质酸钠作为构成细胞外基质和细胞内基质的主要成分，可以促进创伤修复。外源性透明质酸钠可为受损后的组织修复发挥必不可少的模板作用，抑制创伤的挛缩，减少瘢痕的形成。

本公司制备了一种含有透明质酸钠的细菌纤维素敷料，具有修复皮肤屏障功能，根据国标GB/T16886.5-2003，GB/T16886.10-2005所规定的方法，分别进行体外细胞毒性试验、皮内反应试验、迟发型超敏反应试验来评价该敷料的动物实验阶段生物安全性。

1材料和方法

1.1主要材料与试剂

细菌纤维素敷料（自制）；小鼠成纤维细胞L-929（ATCC）；日本大耳白兔（北京隆安实验动物养殖中心）；白化豚鼠（北京隆安实验动物养殖中心）。

1.2细菌纤维素敷料的生物安全性评价

1.2.1体外细胞毒试验

采用四唑盐（MTT）比色法进行试验。选用传代48h生长旺盛的NCTCclone929细胞（小鼠成纤维细胞L-929），采用浸提液试验方法。将配置好的1×104/mL细胞悬浮液接种于96孔板内，每孔100微升，试验设空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和试验样品组，每组各接种6孔。在含5%二氧化碳条件下，37℃培养24h后，弃去培养液，空白对照组用细胞培养液交换，阴性对照组用高密度聚乙烯浸提液交换，阳性对照组用含5%二甲基亚砜的细胞培养液交换，试验样品组用浸提液交换。置含5%二氧化碳培养箱内37℃培养72h后，加MTT继续培养4h，在酶标仪570nm和630nm处测定吸光度。计算相对增值率（RGR），根据RGR判断样品细胞毒性反应级别。

按国家标准，细胞相对增殖度分为5级：≥100%为0级；80%～99%为1级；50%～79%为2级；30%～49%为3级；0～29%为4级。只有细胞毒性为1级或0级的生物材料才能用于体内实验。

1.2.2皮内反应试验

试验采用日本大耳白兔，背部去毛备皮，75%乙醇消毒皮肤，于脊柱两侧各选择10个注射点，每点间隔2cm，每点皮内注射0.2mL试验液。左侧前后5点分别注射试验样品生理盐水浸提液和溶剂对照生理盐水；右侧前后5点分别注射试验样品芝麻油浸提液和溶剂对照芝麻油。注射后24h、48h和72h观察注射局部及周围皮肤组织反应，对出现红斑、水肿和坏死进行评分。

依据GB/T16886.10-2005的要求，将每一试验样品和溶剂对照的全部红斑与水肿记分相加，再除以12[2（动物数）×3（观察期）×2（计分类型）]计算出每一试验样品和每一对应溶剂对照的综合平均记分。如试验样品和溶剂对照平均记分之差不大于1.0，则符合要求。

1.2.3迟发型超敏反应试验

采用豚鼠最大剂量法进行试验。将试验样品生理盐水浸提液以皮内注射和皮肤敷贴的方式对10只受试豚鼠进行皮内诱导和局部诱导，将试验样品芝麻油浸提液以相同方式对10只受试豚鼠进行皮内诱导和局部诱导。皮内注射弗氏完全佐剂予以加强。局部诱导后13天以腹部敷贴法进行激发。10只阴性对照和5只阳性对照也同时进行试验。激发除去敷贴物后24h和48h观察动物激发部位皮肤的红斑、水肿等反应情况，对受试物组与对照组动物的皮肤反应程度进行比较。

按Magnusson和Kligman分级标准（见表1），阴性对照组动物反应等级小于1，而试验组中动物反应等级大于或等于1时认为致敏。

2.2皮内反应试验结果

本试验结果显示，试验样品的生理盐水浸提液的皮内反应记分及溶剂对照的反应记分均为0，试验样品芝麻油浸提液的皮内反应记分及溶剂对照的反应记分均为10，试验样品浸提液和溶剂对照平均记分之差均为0.0，未大于1.0，试验样品的生理盐水和芝麻油浸提液均无潜在皮内刺激作用。

2.3迟发型超敏反应试验结果

本试验结果显示，除去敷贴物24h后，阴性对照和试验样品浸提液组豚鼠激发部位皮肤反应均为0级，阳性对照组皮肤反应为2只1级，2只2级，1只3级。48h后，阴性对照和试验样品浸提液组豚鼠皮肤反应均为0级，阳性对照组皮肤反应为1只0级，2只1级，2只2级。

在本试验条件下，试验样品生理盐水和芝麻油浸提液组动物皮肤反应等级未超过相应的阴性对照组动物反应等级，试验样品浸提液未见引起迟发型超敏反应，无潜在的皮肤致敏性。

3讨论

纤维素是自然界分布最广的天然生物源高分子材料，具有很多独特的性能，如亲水性、生物相容性[3]，绝大部分是由植物产生的，但近年发现一些细菌也能产生纤维素，与天然纤维素相比，细菌纤维素有许多独特的性质：（1）纤维超细。微纤维组成独特的束状纤维，其宽度大约为100nm左右，厚度为3～8nm，属纳米极纤维，是目前最细的天然纤维，其大小仅为人工合成纤维的1/10；（２）高结晶度和高化学纯度。以100%纤维素的形式存在，不含半纤维素、木质素和其它细胞壁成分，提纯过程简单；（3）高抗张强度和弹性模量。BC经洗涤、干燥后，杨氏模量可达10MPa，经热压处理后，杨氏模量可达30MPa，比有机合成纤维的强度高4倍；（4）高持水量（或称高亲水性）。其内部有很多孔道，有良好的透气、透水性能，能吸收60～700倍于其干重的水份，即有非凡的持水性，并具有高湿强度；（5）极佳的形状维持能力和抗撕力。BC膜的抗撕能力比聚乙烯膜和聚氯乙烯膜要强5倍；（6）较高的生物适应性和良好的生物可降解性[4]。

透明质酸钠凝胶是由N-乙酰葡萄糖醛酸反复交替而形成的一种高分子多糖体生物材料，具有高度的粘弹性、可塑性以及良好的生物相容性，在修复软组织方面有明显作用。透明质酸钠在临床中已有广泛的应用，目前已经用于急慢性伤口外用以促进伤口愈合、眼科手术保护剂、外科手术防止粘连等。

本试验选择两种材料结合，运用各自优点，开发出一种适合于皮肤创伤的敷料，并对该材料进行了生物安全性评价，证明该材料体外细胞毒性试验结果符合国家标准，无潜在皮内刺激作用和皮肤致敏性，证实了该材料的安全性，可望应用于临床。

参考文献：

[1]汪丽粉，李政，贾士儒等．细菌纤维素性质及应用的研究进展［Ｊ］．微生物学通报，2014，41（8）：1675-1683.

[2]RainerJonas，LuizF.Farah.Productionandapplicationofmicrobialcellulose[J].PolymerDegradationandStability，1998，59：101-106.

[3]BrownAL.Onanaceticfermentwhichformscellulose[J].J.Chem.Soc.，1886，49：432-439.

[4]谭玉静，洪枫，邵志宇.细菌纤维素在生物医学材料中的应用［Ｊ］.中国生物工程杂志，2007，27（4）：126-131.