醛缩酶B基因真核表达质粒的构建与鉴定

醛缩酶B基因真核表达质粒的构建与鉴定

赵洪波巴亚斯任建林

赵洪波巴亚斯任建林(厦门大学附属中山医院消化内科361004)

【中图分类号】R446.1【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2011)12-0053-03

【摘要】目的构建含ALDOB基因的重组PCMV5质粒并进行鉴定。方法以人HEPG2细胞RNA为模板，用RT-PCR方法扩增出ALDOB基因。将PCR产物克隆进真核载体PCMV5内，构建含ALDOB基因的重组真核表达质粒。重组质粒转染293T细胞，用免疫荧光和Westernblot等方法检测ALDOB在293T细胞中的表达。结果核酸序列分析的结果表明，克隆的ALDOB基因与GenBank中已登记ALDOB基因序列100%同源。免疫荧光结果显示，ALDOB蛋白在细胞质表达；Westernblot结果显示，在约40KD位置有目的条带，与预期的重组ALDOB蛋白大小一致。结论成功构建了含ALDOB基因的真核表达质粒。

【关键词】ALDOB质粒真核表达

ConstructionandverificationofeukaryoticexpressionplasmidcarryinghumanALDOBgene

【Abstract】ObjectiveToconstructandcertificateaneukaryoticexpressionplasmidcarryinghumanALDOBgene.MethodsALDOBgenewasamplifiedbyRT-PCRwiththetotalRNAofhumanHepG2cellastemplate.ThePCRfragmentswereclonedintopCMV5vectortoconstructrecombinanteukaryoticexpressionplasmids.293Tcellsweretransfectedwiththerecombinantplasmids.ImmunofluorescencestainingandWesternblotwereusedtocertificatetheexpressionsofALDOB-mycin293Tcells.ResultsThesequenceofALDOBwas100%homologywithhumanALDOBgenepreviouslyregisteredinGenBank.TheresultofImmunofluorescencestainingmanifestrecombinateproteinofALDOB-mycproteinexpressionin293Tcells;Aninterestingbandabout40kDwasvisibleintheresuultofWesternblot,whichwasconsistentwithexpectedwithexpectedsizeofrecombinateproteinofALDOB-mycexpressedin293Tcells.ConclusionpCMV5-ALDOB-mychasbeenconstructrdsuccessfully.

【Keywords】ALDOBPlasmidEukaryoticexpression

醛缩酶（ALD）与机体能量代谢密切相关。其含量颇丰，分布广泛。应用醋酸纤维素膜电泳测定显示人类和哺乳动物组织中存在3种醛缩酶同工酶，即A(肌型)，B(肝型)和C（脑型）。其中B型基因定位于q13-q32[1]，属胞浆酶[2]。研究表明，ALDOB在肝细胞癌发展过程中呈现出一定规律的变化。本研究分离克隆了ALDOB基因，并将其导入293T细胞中进行真核表达，通过免疫荧光以及Westernblot等技术，验证重组pCMV5-ALDOB-myc质粒表达，为进一步研究ALDOB在肝细胞癌进展过程中的作用奠定基础。

1材料与方法

1.1材料人胚肾（HEK）293T细胞、pCMV5基本载体及宿主菌E.coliTOP10均为本实验室保存。DNA高保真聚合酶，限制性核酸内切酶XBAI、NDEI,T4DNA连接酶均购自TaKaRaBiotechnology有限公司。DNAMarker购自大连宝生物公司。小量胶回收试剂盒购自美国Promega公司，小量质粒抽提试剂盒购自Invitrogen公司。Trizol试剂和反转录试剂盒美国Promega公司产品。质粒转染试剂LipofectamineTM2000Invitrogen公司生产。兔源Anti-myc-tag抗体为Cellsignal公司产品，羊抗兔IgG抗体购自Sigma公司。荧光羊抗兔IgG抗体Sigma公司产品。DAPI染料为Sigma公司产品。PVDF膜为Invitrogen公司产品，蛋白质Marker购自美国MBI公司，ECL显色试剂盒购自Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1构建pCMV5-ALDOB质粒设计1对PCR引物，上下游引物分别引入NDEI、XBAI限制性内切酶位点。以人HepG2细胞cDNA为模版。PCR扩增ALDOB编码基因：上游引物：5□-GGAATTCCATATGGCCCACCGATTTCCAG-3□,下游引物：5□-TGCTCTAGACTAGTAGGTATAGCAGG-CTGTGAAGAGC-3□,上游引物画线部分为NdeI内切酶位点，下游画线部分为XbaI内切酶位点。引物由上海英俊公司合成。琼脂糖凝胶电泳PCR扩增产物，胶回收试剂盒回收DNA片段。限制性内切酶NDEI、XBAI双酶切目的PCR产物和pCMV5基本载体，T4连接酶连接，构建成含ALDOB的真核表达重组质粒pCMV5-ALDOB-myc，转化宿主菌E.coliTOP10，摇菌，送上海英俊公司进行核酸序列测序鉴定。

1.2.2质粒转染采用LipofectamineTM2000转染试剂，按说明书进行转染试验。待293T细胞铺满培养皿80%，将重组质粒pCMV5-ALDOB-myc转入。实验同时以空载体pCMV5转染293T细胞为阴性对照。

1.2.3免疫荧光明确ALDOB在293T细胞中的空间定位将293FT细胞进行细胞爬片处理，待细胞铺满玻片80%，用LipofectamineTM2000转染试剂将重组质粒pCMV5-ALDOB-myc转入。转染36小时，吸干培养液，1xPBS洗一遍。4%多聚甲醛固定，4℃，30min。PBSx3,吸干。0.3%PBST室温通透10min。用滤纸吸干四周，5%BSA封闭1小时，PBSx3。兔源一抗Anti-myc-tag（1：200），37℃，孵育3小时。PBSx3,吸干。荧光兔二抗（1：200），37℃孵育1.5小时。PBSx3,吸干。DAPI染核2min,PBSx3,封片。阴性对照组：一抗用PBS代替，其余步骤同上。用荧光显微镜观察。

1.2.4Westernblot检测ALDOB在293T细胞中的表达收取转染48小时后293T总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，转PVDF膜，1：1000稀释兔源Anti-myc-tag单抗为一抗，1:5000稀释的羊抗兔IgG为二抗，ECL化学发光检测。另外，取空载体转染的293T细胞做为阴性对照。

2结果

2.1目的基因片段的PCR扩增以及重组质粒pCMV5-ALDOB-myc的构建和鉴定

PCR扩增产物经1%的琼脂糖电泳，在约1170bp处出现一明亮特异条带（见图1）。与预期的1170bp扩增片段大小相似。故以的熔点琼脂糖凝胶回收该DNA片段并进行纯化。重组质粒pCMV5-ALDOB-myc送上海英俊公司测序正确。

2.2免疫荧光方法明确ALDOB在293T细胞中空间表达

免疫荧光结果显示,ALDOB蛋白主要定位于胞浆(箭头所示见图2A)。阴性对照组可见无目标蛋白表达（见图2B）。注:蓝色部位为细胞核。

2.3Westernblot结果显示，Anti-myc-tag单抗可特异识别ALDOB重组质粒转染的293T细胞中的蛋白，表现为在约40KD处出现了一条特异性条带，与预期的基因编码蛋白大小相似，而空质粒转染的293T细胞在相应位置为显示出条带，提示ALDOB编码基因在293T细胞中获得表达（图3）。

3讨论

醛缩酶B(EC4.1.2.13)是肝细胞能量代谢过程中的一个重要酶类,与葡萄糖和果糖代谢关系密切,也与糖原异生作用有关。KinoshitaM[3]等应用差异基因显示分析技术（DGDA）分析原发性肝癌组织中基因表达,结果提示90%的样本中醛缩酶B表达下降。同时Adelman和Schapira等[4]证明胚胎性醛缩酶同工酶A在肝癌中重现.肝癌组织中ALD-A“复现”以及ALD-B下调[5]，Bush等人认为，肿瘤中出现胚胎型同工酶谱是由于原来“静止”基因被激活以及基因调控异常的结果。醛缩酶B是一种与糖酵解有关的酶类,其与原发性肝癌的关系是相关还是因果关系，学者们尚未给出明确答案，但有一点值得关注,醛缩酶B可能部分参与原发性肝癌的病理生理过程。GatenbyRA[6]等提出高糖酵解率是肿瘤细胞快速生长获取能量的一种主要方式。肝细胞癌变进展过程中，醛缩酶B活力下降，糖异生作用几乎消失殆尽。为克服不合适血供以及糖酵解酶下调对肿瘤快速生长所造成的能量剥夺，导致肿瘤能量需求模式发生改变。肿瘤发展中，一些关键基因的改变,如P53变异和HIF-1激活[7]，与糖酵解密切相关。上述表明醛缩酶B在肝癌发展变化中起着一定作用，但具体机制未明。

本实验以人HEPG2细胞cDNA为模板，PCR扩增ALDOB基因编码序列，成功构建了pCMV5-ALDOB-myc表达质粒。免疫荧光以及Westernblot结果证实：载体pCMV5-ALDOB-myc在真核细胞中能有效地表达ALDOB蛋白。这一载体的成功构建为下一步研究ALDOB在肝细胞癌发生、发展中所起的作用提供了前提基础。

参考文献

[1]A.Baldini,D.I.Smith,M.Rocchi,O.J.Miller,D.A.Miller.AhumanalphoidDNAclonefromtheEcoRIdimericfamily:GenomicandinternalorganizationandchromosomalassignmentGenomics,Volume5,Issue4,November1989,Pages822-828.

[2]周玉球，卢义钦，刘俊凡.醛缩酶及其同工酶研究进展.国外医学分子生物学分册1993；15：237-238.

[3]KinoshitaM,MiyataM.UnderexpressionofMrnainhumanhepatocellularcarcinomafocusingoneightloci.Hepatology2002;36:433-438.

[4]AntoinetteHatzfeld,FannySchapira.Theontogenyofaldolaseinratliverandbrain.Biochimie1973;55:53-57.

[5]HaiSong,Shuang-LuoXia,ChengLiao,Yi-LiangLi,Yi-FeiWang,Tsai-PingLi,Mu-JunZhao.GenesencodingPir51,Beclin1,RbAp48andaldolasebareupordown-regulatedinhumanprimaryheptocellarcarcinoma.WorldJGastroenterol2004;10:509-513.

[6]GatenbyRA,GilliesRJ.Whydocancershavehighaerobicglycolysis?.NatRevCancer2004;4:91-92.

[7]HaussingerD,SchliessF.Glutaminemetabolismandsignalingintheliver.FrontBiosci2007;12:371-391.