超高效液相色谱法检测食品黄曲霉毒素

超高效液相色谱法检测食品黄曲霉毒素

全德甫王晖孙华杰

全德甫王晖孙华杰（深圳市宝安区观澜预防保健所广东深圳518110）

【中图分类号】R445【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）24-0021-03

黄曲霉毒素(Aflatoxin)是常见霉菌黄曲霉(AspergiUusflavus)和寄生曲(A.parasiticus)中产毒菌株的代谢产物。主要毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2,其中AFB1是毒性和危害最大的一种,AFB2和AFG2是AFB1和AFG1的双羟基衍生物[1]。黄曲霉毒素是目前所知致癌性最强的化合物,广泛存在于花生、花生油、大米、玉米、糕点等粮油食品和动物饲料中,严重影响人们的健康,甚至威胁着人们的生命安全[2]。

对黄曲霉毒素的检测方法主要有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、二维薄层色谱法等。近年来,由于超高压液相色谱技术的引进,色谱分析效率、分析时间、灵敏度得到了比较大的提高。本文建立用超高效液相色谱法（UPLC）同时测定食品中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2分析时间短、灵敏度高,特异性强,结果满意。

1材料和方法

1.1仪器和试剂超高效液相色谱系统：WATERSACQUITYUPLC型超高效液相色谱仪；色谱柱：WATERSACQUITYUPLCBEHC18（直径1.7μm，宽×长为2.1mm×50mm）；Mycosep?228黄曲霉毒素多功能净化柱（美国RomerLabs）；LV型自动蒸发浓缩仪；烘干箱；电动振荡器；漩涡混合器；电子天平。乙腈、三氟乙酸、正已烷（色谱纯）；石油醚（30～60℃，分析纯）；水，电导率（25℃）≤0.01ms/m。AFB1、AFB2、AFG1、AFG2标准溶液（美国Supelco）。标准工作液：准确移取上述标准溶液适量，置10ml容量瓶中,加乙腈稀释至刻度，使成为500.0μg/L的标准工作液，密封后避光40℃保存。

1.2超高效液相色谱条件色谱柱为WATERSACQUITYUPLCBEHC18（直径1.7μm，宽×长为2.1mm×50mm）,柱温：30℃；进样量：5μl；荧光检测器：激发波长：362nm；发射波长：455nm；流动相由乙腈与水组成，流速：0.3ml/min。

1.3实验方法

1.3.1试样提取

1.3.1.1较高油脂食品称取10g经充分粉碎过的试样于250ml碘量瓶中，加入40ml乙腈和水（体积分数比为84%:16%）提取液，20ml石油醚，在电动振荡器上振荡30min后，定性滤纸过滤，收集滤液于125ml分液漏斗中，静置分层后，放出下层乙腈-水提取液于试管中备用。

1.3.1.2低油脂食品称取10g经充分粉碎过的试样于250ml碘量瓶中，加入40ml乙腈和水（体积分数比为84%:16%）提取液，在电动振荡器上振荡30min后，定性滤纸过滤，收集滤液于试管中备用。

1.3.2试样净化称取约8ml提取液置多功能净化柱的玻璃管中，将多功能净化柱的填料管插入玻璃管中并缓慢推动填料管，净化液就被收集到多功能净化柱的收集池中。

1.3.3试样衍生化从多功能净化柱的收集池内转移2ml净化液到棕色具塞小瓶中，于自动蒸发浓缩仪上（60±1）℃水浴下氮气吹干。加入200μl正已烷和100μl三氟乙酸，密闭混匀30s后，在（40±1）℃烘干箱中衍生15min。于自动蒸发浓缩仪上室温水浴下氮气吹干，以200μl水和乙腈（体积分数为比85%:15%）溶液溶解，混匀30s，经0.22μm微孔滤膜过滤，供超高效液相色谱（UPLC）分析。

1.3.4标准系列溶液的制备准确称取上述标准工作液适量，置10.0ml容量瓶中,加乙腈稀释至刻度，使成为分别含AFG1、AFB1为0.00、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00、50.00、100.00μg/L，AFG2、AFB2为0.00、0.05、0.25、0.50、2.50、5.00、25.00、50.00μg/L的标准系列溶液。

吸取标准系列溶液各200μl，于自动蒸发浓缩仪上（60±1）℃水浴下氮气吹干，衍生方法同1.3.3。

1.3.5测定吸取5μl样液进样，进行超高效液相色谱（UPLC）分析，黄曲霉毒素按照AFG1、AFB1、AFG2、AFB2的顺序出峰，记录每种黄曲霉毒素的峰面积，根据每种黄曲霉毒素的保留时间定性，峰面积外标法定量。

2结果与讨论

2.1样品前处理条件选择样品提取可以采用有甲醇-磷酸二氢铵缓冲液加冰醋酸、甲醇-水、氯仿、乙腈-水作提取剂,对甲醇-水、乙腈-水等不同配比的提取液提取效果进行了比较，实验表明，选用乙腈和水（体积分数比为84%:16%）作样品提取液，4种黄曲霉毒素和样品中干扰物能达到较好的基线分离，稳定性好，回收率高。石油醚能有效去除样品中富含的油脂，多功能净化柱含有反相离子交换吸附剂，可去除脂肪、蛋白质、色素及碳水化合物等干扰物质。

2.2样品纯化方法的选择固相萃取(SPE)是一种用途广泛而且越来越受欢迎的样品前处理技术之一,它操作简便、快速、安全、高效、应用范围广、溶剂用量少等优点。目前,专用于黄曲霉毒素分离纯化的固相萃取有免疫亲和柱(IAC)[3]和多功能净化柱（MFC）[4],前者是将黄曲霉毒素特异性的抗体与适当的固定相结合填柱而成特异性强、灵敏度高,但价格高;后者可有选择的吸附样液中的脂类、蛋白类等杂质,黄曲霉毒素不被吸附而样液得到净化，操作简单、快速、溶剂用量少、净化效果好等优点。本法选用美国RomerLabs公司Mycosep?228净化柱,经过对市售食品样品的应用,取得了满意的纯化效果,可达到分析测定的要求。

2.3检测波长的选择在上述色谱条件下选择激发波长同为362nm，发射波长分别为440、425、455nm等多波长同时测定AFG1、AFB1、AFG2、AFB2，综合考虑灵敏度、基体吸收、杂质干扰等因素,选择激发波长为362nm，发射波长为455nm作为测定波长。此波长下4种黄曲霉毒素分离效果好、基线稳定、灵敏度高、稳定性好。

2.4色谱柱、流动相的选择选用色谱柱为WATERSACQUITYUPLCBEHC18（直径1.7μm，宽×长为2.1mm×50mm）,流动相由乙腈与水组成，流速：0.3mL/min，梯度洗脱的变化如表1。超高效液相色谱法（UPLC）系统在高压下低扩散输送流动相的特殊能力，结合亚2-μm杂化颗粒色谱柱，充分发挥这种小颗粒化学组分在色谱分析方面的优点，能得到更尖、更集中的色谱峰，不损失分离度的高速度优点；UPLC增加了通量，减少了溶剂使用量。实验表明，在此色谱条件下在5mim内4种黄曲霉毒素的峰达到较好基线分离，出峰时间合适，峰形较好，其保留时间分别为：AFG1（2.201min）、AFB1（2.683min）、AFG2（3.766min）、AFB2（4.463min）。

表1流动相的梯度变化

2.5方法的线性与检出限AFG1、AFB1标准溶液质量浓度范围为0.10～100.0μg/L，AFG2、AFB2为0.05～50.00μg/L，在上述色谱条件下，相关系数均大于0.999，检出限也符合要求。

2.6方法的回收率和精密度用本法对大米、玉米、花生、油炸面点样品分别进行1μg/kg、4μg/kg、10μg/kg三个水平的加标回收实验,每个水平平行测定6次,回收率在80.0%～101.2%之间，相对标准偏差（RSD）＜5%（n=6）。

2.7干扰实验在本法条件下对食品中尤其基质复杂样品如油炸面点中富含的油脂、蛋白质、碳水化合物等进行考察,结果表明均不会形成干扰。

2.8实际样品测定对49份样品（包括大米、玉米、花生、油炸面点等品种）用本法进行测定，AFG1、AFB1、AFG2、AFB2均有不同程度检出，结果见表2。

表2实际样品黄曲霉毒素测定结果（μg/kg）

3结论

本法应用乙腈水提取样品，经黄曲霉毒素多功能净化柱（MFC）净化，以三氟乙酸衍生后,用带有荧光检测器的超高效液相色谱仪（UPLC）测定，具有快速、简便、灵敏等优点，而且对基质复杂样品如油炸面点中富含的油脂、蛋白质、碳水化合物等均不形成干扰，适用于食品中4种黄曲霉毒素水平的同时测定。

参考文献

[1]吕嘉枥.食品微生物学[M].北京:化学工业出版社,2007.

[2]俞雪钧,康继韬,孙大为,等.免疫亲和柱HPLC快速测定蜂蜜中黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1[J].光谱实验室,2001,18(1):28-23.

[3]孙桂菊,贺霞,钱耕荪,等.尿中黄曲霉毒素代谢物的高效液相色谱测定法[J].卫生毒理学杂志,2000,14(4):250-252.