猪来源抗胸腺细胞球蛋白对食蟹猴免疫功能影响

猪来源抗胸腺细胞球蛋白对食蟹猴免疫功能影响

赵越王筱啸钟山向莹陈刚（通讯作者）

赵越王筱啸钟山向莹陈刚（通讯作者）

（华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所430030）

【摘要】目的研究猪来源抗胸腺细胞球蛋白（ATG）对食蟹猴免疫功能的影响。方法ATG倍比稀释与食蟹猴淋巴细胞孵育，流式检测细胞毒；ATG单纯给药组分为低剂量组（250mg/日）及高剂量组（750mg/日），分别连续给药5日，并于定期检测血常规以及用流式细胞仪检测CD3/CD20、CD4/CD8细胞的比例。结果ATG对食蟹猴淋巴细胞具有很强的杀伤作用，滴度为1：2时杀伤率为84.95%，直至滴度为1:512时才降至10%以下；给药期间体内单纯给药高剂量组与低剂量组对总淋巴细胞清除率无明显差别，但各组对CD8+淋巴细胞杀伤作用均强于CD4+淋巴细胞（P<0.01）。结论ATG可以杀伤食蟹猴淋巴细胞，其中对CD8+淋巴细胞效果更显著。

【关键词】抗T细胞球蛋白食蟹猴同种异体肾移植淋巴细胞

【中图分类号】R39【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）07-0222-02

TheinfluenceofPorcinederivedantithymocyteglobulinincynomolgusimmunesystem

ZHAOYue1,WANGXiaoxiao1,ZHONGShan1，XIANGYing1，CHENGang1

(1.InstituteofOrganTransplantation,TongjiHospital,TongjiMedicalCollage,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030)

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheinfluenceofATGoncynomolgusimmunefunction.MethodsCynomolguslymphocyteswereincubatedwithvariousconcentrationsofATGtodetectcytotoxicitybyflowcytometry;InATGintravenousinfusionexperiment,cynomolgusarepidedintotwogroups:lowdosagegroup(250mg/day)orhighdosagegroup(750mg/day)andrecivedintravenousinfusionfor5days.BloodsampleswerecollectedforbloodroutineanalysisandCD3,CD20,CD8andCD4percentagebyflowcytometry.ResultsATGhasstrongcytotoxicityeffectagainstcynomolguslymphocyte.WhenATGtiterwas1:2,thelysisratewas84.95%,andthelysisratedroppedbelow10%whenthetiterreached1:512.ThereisnodifferenceininvivoATGintravenousinfusionexperimentbetweenHighdosagegroupandlowdosagegroupingeneraldepletionrateduringadministrationperiod.TheCD8positivecellsdepletionrateisstrongerthantheCD4positivecellsdepletionrate.ConclusionATGhasacytotoxityeffectagainstcynomolguslymphocytes.

【Keywords】antithymocyteglobulincynomolgusrenalallotransplantationlymphocytes

引言

抗T细胞球蛋白（AntithymocyteGlobulin,ATG）是针对T细胞的多克隆抗体，可以通过淋巴毒作用清除人外周血及淋巴结组织中的T细胞[1]。目前在临床上，ATG被广泛用于骨髓移植后的移植物抗宿主病[2]、再生障碍性贫血[3]及实体器官移植前诱导治疗[4]。其中应用于实体器官移植术前可以有效降低急性排斥反应的发生率同时延长移植物存活[4]。但是由于ATG是以人胸腺细胞为来源制备的抗体，在非人灵长类动物中对淋巴细胞杀伤作用及应用于移植中机制疗效尚不明确。

本文就ATG对食蟹猴（Cynomolgus,Macacafascicularis）肾移植模型探讨猪来源ATG对食蟹猴体内外淋巴毒效应，并评价其对灵长类动物各淋巴细胞亚群变化影响。

2.材料和方法

2.1实验动物及材料

健康雄性食蟹猴共10只，体重4.75-7.7kg，均购自广州蓝岛生物技术有限公司华南非人灵长类研究开发中心。ATG为国产猪来源ATG。所用流式抗体均购自BD公司。

2.2体外淋巴毒（CDC）效应检测

抽取正常猴外周血，采用猴淋巴细胞分离液分离淋巴细胞作为被杀伤的靶细胞。将三批次ATG倍比稀释为1:2至1:1024，取200ul细胞悬液与20ul不同稀释比值ATG孵育，并分别在兔补体的辅助下与猴淋巴细胞作用30min，PI染色标记死亡细胞流式细胞仪检测淋巴细胞死亡率。

2.3体内注射ATG对猴外周血淋巴细胞数量的影响

将六只食蟹猴随机分为三组：低剂量组：每日静脉注射剂量为250mg，连续注射5天；高剂量组：每日静脉注射剂量为750mg，连续注射5天。分别于第0、1、2、3、4、5、7、10、14日检测血常规以及用流式检测CD3/CD20、CD4/CD8细胞的比例。

3.结果

3.1抗人T细胞猪免疫球蛋白体外杀伤猴淋巴细胞情况

体外淋巴毒实验中，在ATG稀释度为1:2时，杀伤率均较高，随着ATG的进一步倍比稀释，杀伤率逐渐下降稀释至1:512之后降至10%以下。

Fig.1ThecytotoxicityeffectofATGagainstcynomolgyslymphocytes

3.2ATG体内应用对猴外周血淋巴细胞数量及免疫功能的影响

体内静脉注射不同剂量ATG后，各组白细胞总数变化较无明显规律（图2），而各组淋巴细胞总数均在给药一天后降至基线值的一半以下，给药期间淋巴细胞总数在该值附近波动，停止给药后缓慢上升，两种剂量的ATG效果类似，高剂量组并未增加杀淋巴细胞效应（图2）。各组淋巴细胞亚群中，代表B细胞的CD20+细胞数量变化均不明显（图2）。而代表T细胞的CD3+细胞数量在给药一天后即降至基线值的一半以下，停止给药后缓慢恢复（图2）。T细胞亚群CD4+细胞变化趋势与CD3+细胞类似(图2）。体内淋巴细胞清除率用（基础淋巴细胞数-ATG治疗后淋巴细胞数)/基础淋巴细胞数×100%来表示。ATG治疗后最显著的是CD8+T淋巴细胞，以第一日为例，给药后各组体内CD4+T淋巴细胞数量迅速大幅降低(图3)，而CD8+细胞下降幅度更大，与CD4+细胞相比，具有统计学差异（P<0.01）。停止给药后，各组CD4+及CD8+细胞数量缓慢回升（图2）。总体来说，各组体内杀伤淋巴细胞情况相似，且无论何种浓度，ATG对CD8+细胞杀伤率均高于CD4+细胞。

（实心块为低剂量组空心块为高剂量组）

Fig.2Alternationsofperipheralbloodcells（lowdosagegroupisrepresentedinclosedsquare,highdosagegroupisrepresentedinopensquare）

3.讨论

ATG在体外可以通过补体经典途径介导淋巴细胞杀伤，另外，还可以诱导活化T淋巴细胞Fas/FasL通路介导细胞凋亡[5]。除了淋巴毒效应外，ATG还可以调节介导白细胞以及内皮细胞相互作用的关键细胞表面标志、诱导B淋巴细胞系的凋亡、与树突状细胞功能成分相互作用以及诱导调节性T细胞和自然杀伤T细胞的生成[1]。本实验中ATG在兔补体的辅助下能较高效杀伤猴淋巴细胞,在体内使用ATG的结果CD20+细胞变化不大，说明ATG主要针对T细胞，而对B细胞影响较小，但对CD3+细胞、CD4+细胞及CD8+细胞亦有明显清除作用。且清除作用主要表现在CD8+细胞上。

本研究证实ATG可以杀伤食蟹猴T淋巴细胞，主要是CD8+淋巴细胞。本研究为临床上应用ATG以清除外周T淋巴细胞治疗提供理论依据。

参考文献

[1]MMohty.Mechanismsofactionofantithymocyteglobulin:T-celldepletionandbeyond.Leukemia(2007)21,1387–1394

[2]StorbR,GluckmanE,ThomasED,etal.Treatmentofestab-lishedhumangraft-versus-hostdiseasebyantithymocyteglobulin.Blood1974;44(1):56.

[3]MarshJ,SchrezenmeierH,MarinP,etal.Prospectiverandomizedmulticenterstudycomparingcyclosporinealoneversusthecombinationofantithymocyteglobulinandcyclosporinefortreatmentofpatientswithnonsevereaplasticanemia:areportfromtheEuropeanBloodandMarrowTransplant(EBMT)SevereAplasticAnaemiaWorkingParty.Blood1999;93(7):2191.

[4]BrennanDC,DallerJA,LakeKDCibrikD,DelCastilloD;ThymoglobulinInductionStudyGroup.Rabbitantithymocyteglobulinversusbasiliximabinrenaltransplantation.NEnglJMed2006;355:1967-1977

[5]GenestierL,FournelS,FlacherM,AssossouO,RevillardJP,Bonnefoy-BerardN.InductionofFas(Apo-1,CD95)-mediatedapoptosisofactivatedlymphocytesbypolyclonalantithymocyteglobulins.Blood1998;91(7):2360.