复方地龙胶囊对哮喘小鼠血清IL-13的作用

复方地龙胶囊对哮喘小鼠血清IL-13的作用

崔素华1,2丁伯平1黄维琳2唐国华3

崔素华1、2丁伯平1黄维琳2唐国华3（1皖南医学院药理教研室安徽芜湖241000)(2安徽中医药高等专科学校安徽芜湖241000)(3芜湖市第一人民医院安徽芜湖241000）

【摘要】目的探讨复方地龙胶囊对哮喘小鼠血清白细胞介素-13（IL-13）的作用，从分子水平研究其治疗哮喘的可能机制。方法采用卵白蛋白腹腔注射致敏建立小鼠支气管哮喘模型，用复方地龙胶囊、地塞米松与生理盐水对小鼠进行干预,用酶联免疫吸附法（ELISA）检测小鼠血清白细胞介素-13（IL-13）的表达水平。结果哮喘模型组小鼠血清IL-13含量显著高于正常对照组（P<0.01）；复方地龙胶囊各剂量组及地塞米松组IL-13含量水平均明显低于哮喘模型组（P<0.05）；复方地龙胶囊各剂量组与地塞米松组比较，差异不显著（P>0.05）。结论复方地龙胶囊可能通过影响哮喘小鼠血清IL-13的水平，调节免疫系统产生治疗作用。

【关键词】复方地龙胶囊哮喘IL-13

支气管哮喘是由多种细胞包括气道的炎性细胞和结构细胞（如嗜酸粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、平滑肌细胞、气道上皮细胞等）和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病[1]。流行病学研究表明，哮喘的发病率和病死率具有全球性上升的趋势[2]。据世界卫生组织估计，全球大约有3亿哮喘患者。防治哮喘已成为全球公共卫生问题。

哮喘的主要特征是气道嗜酸性粒细胞浸润、支气管痉挛和气道高反应。免疫反应在哮喘的发病机制中占有重要地位。根据细胞因子分泌及效应功能的不同，抗原特异性CD4+T细胞分为1型辅助性T淋巴细胞（Thl）和2型辅助性T淋巴细胞（Th2）两类。现研究认为哮喘发病的重要基础是Thl／Th2细胞类细胞因子比例和功能失衡[3]。Thl和Th2细胞之间处于相互抑制状态，两者形成复杂有序的细胞因子网络，调节正常的免疫应答。正常情况下，两者处于一种平衡状态。Th细胞中的Thl／Th2平衡失调，Th2细胞数目增多及功能亢进是哮喘发病的重要基础之一[4]。哮喘时浸润至气道的主要为Th2细胞，Thl细胞相对较少；由Th2细胞所产生的Th2类细胞因子IL-5、IL-13等在哮喘气道表达的mRNA及蛋白水平均过度增高；Thl类细胞因子如IFN-r相对不足。IFN-r和IL-5、IL-13分别是Thl和Th2免疫反应的代表性细胞因子，体现着Thl和Th2细胞的主要生物学效应。Th2类细胞因子IL-5、IL-13等产生增多，而Thl类细胞因子IFN-r等产生减少，从而导致B细胞合成增多、嗜酸性粒细胞活化浸润气道及气道高反应性。因此调节Thl／Th2平衡对哮喘的治疗具有重要意义,促进Th0细胞向Thl细胞分化，抑制Th2型细胞因子的产生，调节Thl／Th2的反应失衡可能用于防治哮喘。由于Th2细胞因子在哮喘等过敏性炎症的发生发展中起的重要作用，以此为靶点的研究是目前哮喘治疗研究中的热点[5-8]。

1材料与方法

1.1实验对象

48只清洁级健康小鼠，体重30±2g，雌雄各半，购自南京青龙山实验动物中心。

1.2主要仪器

全自动电子雾化器（南京道芬电子仪器厂），80-2型离心机（上海手术机械厂），微量移液器（上海求精玻璃仪器厂），电热恒温水箱（上海医用恒温设备厂），酶标仪（美国Costar公司）。

1.3主要试剂

卵白蛋白（合肥博美生物科技有限责任公司）、复方地龙胶囊（南京恒生制药厂，批号：Z199991007）、小鼠白细胞介素13定量检测试剂盒（ELISA）（深圳晶美生物公司）。

1.4动物分组

48只小鼠随机分为6组，每组8只。A组为空白对照组，B组为哮喘模型组，C组为复方地龙胶囊高剂量组(0.9mg/g/d)，D组为复方地龙胶囊中剂量组(0.6mg/g/d)，E组为复方地龙胶囊低剂量组(0.3mg/g/d)，F组为地塞米松激素治疗组(1.5mg/kg/d)。

1.5建立模型

采用鸡卵清蛋白（OVA）腹腔注射及雾化吸入方法制造小鼠哮喘模型。小鼠适应性饲养一周，空白对照组以生理盐水致敏和引喘，其余各组于d1、8天分别腹腔注射含10%OVA100ug、明矾2mg混悬液0.3ml致敏，两周后小鼠逐个放入体积约5L的透明密闭容器中，雾化吸入1%OVA（200mgOVA溶于生理盐水20ml）20分钟，连续7天，小鼠出现明显腹肌收缩、鼻部潮湿、喷嚏、紫绀、烦躁、激惹等呼吸道症状，证明激发成功。

1.6治疗方法

空白对照组、哮喘模型组在每次激发前1h以生理盐水灌胃，地塞米松组在每次激发前1h腹腔注射1.5mg/kg地塞米松注射液，复方地龙胶囊高、中、低剂量组在每次激发前1h分别予小鼠复方地龙胶囊0.9mg/g、0.6mg/g、0.3mg/g灌胃。

1.7标本获取

全部动物于末次激发后1h，眼眶动脉取血4-5ml。所取血液在4℃，4000r/min离心30min,留置血清于低温冰箱中备用。

1.8ELISA流程

（1）准备：从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30分钟。（2）配液：用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。（3）加标准品和代测样本：取足够数量的酶标包被板，固定于框架上，分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，在标准品孔中加入标准品50µl；待测样本孔先加入待测样本10µl，再加样本稀释液40µl.（4）温育。（5）洗板。(6)加酶标工作液。（7）温育。（8）洗板。（9）显色。（10）终止。（11）测定。（12）计算：根据标准品的浓度及对应的OD值，计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样本的OD值，在回归方程上计算出对应的样品浓度。最终浓度为实际测定浓度乘以稀释倍数。

1.9统计学处理

各指标（记量资料）均以表示，运用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析及直线相关分析,组间差异比较用t检验，设定p<0.05为有显著性差异。

2结果

2.1复方地龙胶囊对哮喘小鼠血清IL-13的影响

哮喘模型组小鼠血清IL-13含量显著高于正常对照组（P<0.01）；复方地龙胶囊高、中、低剂量组及地塞米松组IL-13含量水平均明显低于哮喘模型组，差异有显著性（P<0.05）；复方地龙胶囊高、中、低剂量组与地塞米松组比较，差异没有显著性（P>0.05）（见表）。

表1不同组别小鼠血清IL-13的表达（n=8,x±s）

与正常对照组比较:*P＜0.01；与复方地龙胶囊中剂量组比较:▲P＜0.05；与哮喘模型组比较：●P＜0.05●●P＜0.01

3讨论

哮喘是一种气道慢性炎症性疾病,以气道嗜酸性粒细胞浸润、支气管痉挛和气道高反应为主要特征。现代医学认为，Th2优势分化及其所产生的细胞因子在哮喘的发病过程中起到关键性调节作用。

现代医学对哮喘的治疗仍然首选糖皮质激素全身或局部用药，但长期应用副作用明显。中医药重视整体调节，治疗本病有潜在优势。地龙是钜蚓科动物参环毛蚓或缟蚯蚓的干燥体，性味咸寒，能清热、熄风、平喘、通络、利尿，是一味用途广泛的中药。《本草纲目》指出：“其性寒而下行，性寒故能解诸热疾，下行故能利小便，治足疾而通经络也。”在治疗哮喘方面，地龙有较强的药理效应，其平喘作用与其抗炎、抗组胺和解痉作用有关[9]。目前世界各国对地龙的研究日益深入和广泛，另外地龙资源丰富，提取成本低廉，提取物毒副作用低，疗效显著[10]。复方地龙胶囊是由地龙、川穹、黄芪和牛膝等组成的中药三类新药。其处方由清-王清任《医林改错》中的补阳还五汤化裁而来[11]。

本研究发现，复方地龙胶囊能抑制哮喘小鼠肺组织中IL-13的表达，明显抑制了小鼠的炎症和肺部EOS浸润。本研究相关分析表明，肺组织中IL-13的表达与白细胞计数和EOS计数密切相关，提示复方地龙胶囊治疗哮喘可能是通过抑制哮喘小鼠中IL-13而实现，复方地龙胶囊抑制小鼠气道炎症及IL-13的效果与地塞米松比较无明显差异，且无激素类似的副作用，表明复方地龙胶囊在哮喘的治疗方面有进一步开发应用的价值。

参考文献

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