促红细胞生成素对糖尿病大鼠视网膜形态的影响

促红细胞生成素对糖尿病大鼠视网膜形态的影响

李晋1,3李华2陈雪艺3

李晋1,3李华2陈雪艺3

1.中国新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市，兰州军区乌鲁木齐总医院眼科830000;

2.中国新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市，武警新疆兵团指挥部医院眼科830063;

3.中国新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市，新疆医科大学第一附属医院眼科830054）

作者简介：李晋，男，硕士，主治医师，研究方向：眼底病。通讯作者：陈雪艺，女，毕业于中山大学眼科中心获硕士学位，副教授，硕士研究生导师，主任医师，科主任，新疆医学会眼科分会副主任委员，《新疆医科大学学报》编委，主要从事眼底病的临床诊治及眼病流行病学调查工作，出版书籍《眼部疾病鉴别诊断》。

【摘要】目的：观察促红细胞生成素对糖尿病大鼠视网膜形态学影响。方法：将45只Wistar大鼠随机分成3组,即正常对照组、糖尿病模型组和EPO干预组,链尿佐菌素诱导糖尿病大鼠模型,6wk后行视网膜光镜、电镜观察。结果：正常组大鼠视网膜组织结构完整,视网膜分层清晰,细胞形态完好;糖尿病模型组视网膜组织结构完整,视网膜分层稍紊乱,神经节细胞层、内颗粒层及外颗粒层细胞减少、排列紊乱，神经节细胞层可见明显细胞水肿、嗜酸样变性及少量坏死；rhEPO干预组视网膜组织结构完整，视网膜分层清晰，与正常组接近。正常大鼠视网膜透射电镜下见细胞排列紧密，未出现明显的空泡变性，神经节细胞形态正常,自视杆视锥层至神经纤维层的超微结构未见明显改变;糖尿病组大鼠视网膜出现大量空泡变性,神经节细胞及内颗粒层细胞出现空泡改变，线粒体肿胀，线粒体嵴断裂、消失；rhEPO干预组大鼠视网膜在透射电镜下可见细胞排列紧密,有少量空泡改变,神经节细胞形态接近正常,内颗粒层细胞的超微结构未见明显改变。结论：EPO对早期糖尿病大鼠视网膜病变具有防治作用。

【关键词】糖尿病视网膜病变；促红细胞生成素；视网膜形态学；大鼠

【中图分类号】R587.2【文献标识码】B【文章编号】1008-6455（2010）09-0134-02

糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy，DR)是糖尿病严重并发症之一，是造成视力丧失和致盲的主要原因[1]。目前越来越多的实验支持在糖尿病模型建模成功后早期就发生了视网膜血管内皮的损伤[2，3]和神经组织代谢异常[4]，并且有学者认为糖尿病引起的视网膜神经元和(或)神经胶质细胞的改变早于糖尿病视网膜微血管病变[5]。近年来研究发现促红细胞生成素(EPO)具有重要的促神经元生长和神经元保护作用[6]，并且对早期糖尿病大鼠视网膜神经胶质细胞有保护作用[8]。本实验通过对EPO干预后早期糖尿病大鼠视网膜光镜及电镜的观察,为DR的预防和治疗提供实验依据。

1材料和方法

1.1材料:健康Wistar大鼠45只,雌雄不限，体重(200±20)g，随机分为正常对照组、糖尿病模型组和EPO干预组,每组15只。链尿佐菌素(Sigma)，重组人促红细胞生成素（成都地奥九鸿制药），视觉电生理（重庆康华公司APS-2000）。

1.2方法

1.2.1动物模型及给药:大鼠适应性喂养1wk，禁食12h，以60mg/kg链尿佐菌素(Sreptozotocin，STZ，临用前用0.1mmol/L、pH4.2的柠檬酸2柠檬酸钠缓冲液配成20g/L的溶液)快速一次性左下腹腔注射建立糖尿病模型,给药后24h及1wk时测血糖,高于16.7mmol/L者为糖尿病建模成功。干预组于造模成功1wk后按5000IU/kg剂量腹腔内注射重组人促红细胞生成素(rHuEPO)，2次/wk,共6wk。

1.2.2光镜切片的制备:断颈处死实验大鼠，迅速摘除眼球（9眼行电镜制备），清洗表面后投入10%甲醛液中固定24h，去除眼前节及玻璃体，梯度酒精脱水、二甲苯透明，浸蜡和石蜡包埋，做4um连续切片，常规HE染色，光学生物显微镜下观察视网膜形态。

具体过程：采集标本→动物→处死→摘除眼球→固定→冲洗→脱水或保存→透明→透蜡→包埋→修块→切片→贴片机展片→烘干→脱蜡→染色→封片。

1.2.3电镜切片的制备:从每组摘除眼球中再各随机选取3眼，共9眼，去除眼前节和玻璃体，用4%戊二醛液固定24h以上，将其切成1mm×2mm的条块，继续固定24h，0.1mol/L磷酸缓冲溶液浸洗30min，1%四氧化锇1ml固定1.5h，再用磷酸缓冲液1.5ml冲洗15min，50%、70%、90%丙酮脱水各15min，100%丙酮脱水10min，EPON812环氧树脂包埋，37℃温箱过夜，60℃温箱放置48h，LKB-2188型切片机切取1um半薄切片，定完后切取超薄切片，铅-铀双重电子染色，JEOL-JEM-1230型电镜观察视网膜超微结构。

2结果

2.1光镜切片观察:正常组大鼠视网膜组织结构完整,视网膜分层清晰,细胞形态完好;糖尿病模型组视网膜组织结构完整,视网膜分层稍紊乱,细胞排列及形态可见异常，神经节细胞层、内颗粒层及外颗粒层细胞减少、排列紊乱，神经节细胞层可见明显细胞水肿、嗜酸样变性及少量坏死；rhEPO干预组视网膜组织结构完整，视网膜分层清晰，内颗粒层细胞可见少量嗜酸样变性，神经节细胞层细胞无水肿，未见坏死，与正常组接近。（图1、2、3）

2.2电镜切片观察:正常大鼠视网膜在透射电镜下可见细胞排列紧密，未出现明显的空泡变性，神经节细胞形态正常,自视杆视锥层至神经纤维层的超微结构未见明显改变;糖尿病组大鼠视网膜出现大量空泡变性,神经节细胞及内颗粒层细胞出现空泡改变，线粒体肿胀，线粒体嵴断裂、消失；rhEPO干预组大鼠视网膜在透射电镜下可见细胞排列紧密,有少量空泡改变,神经节细胞形态接近正常,内颗粒层细胞的超微结构未见明显改变(图4、5、6、7、8、9)。

3讨论

促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)是组织氧合状态的一种主要的糖蛋白激素,由193个氨基酸组成,对机体供氧状况发挥重要的调控作用[7]，组织缺氧是刺激EPO合成释放的主要因素。1985年利用基因重

组技术开始批量生产重组人EPO（recombinanthumanerthroietin,r-huEPO）,广泛用于临床[8]。传统认识中，EPO是一种作用于骨髓造血细胞，促进红系祖细胞增生、分化、成熟的内分泌激素。近来研究表明EPO具有具常重要的非造血作用，尤其是发现EPO参与了缺血的视网膜神经元的保护[9]。我们分别观察了正常大鼠、糖尿病大鼠及rhEPO干预后糖尿病大鼠视网膜光镜及电镜改变，正常组大鼠视网膜组织结构完整,视网膜分层清晰,细胞形态完好;与正常组相比,糖尿病模型组视网膜组织结构完整,视网膜分层稍紊乱,细胞排列及形态可见异常，神经节细胞层、内核层及外核层细胞减少，并可见细胞水肿、嗜酸样变性及少量坏死；rhEPO干预组视网膜组织结构完整，视网膜分层清晰，细胞形态与正常组接近。正常大鼠视网膜在透射电镜下可见细胞排列紧密,未出现明显的空泡变性,神经节细胞形态正常,自视杆视锥层至神经纤维层的超微结构未见明显改变;糖尿病组大鼠视网膜与正常组大鼠比较,视网膜出现大量空泡变性,位于神经节细胞层和神经纤维层出现异常,表现为神经节细胞内线粒体肿胀,线粒体嵴断裂、消失;rhEPO干预组大鼠视网膜在透射电镜下可见细胞排列紧密，未出现明显的空泡变性,神经节细胞形态基本正常。糖尿病视网膜病变主要是视网膜的缺血、缺氧所引发，由于视网膜神经细胞对缺血缺氧极为敏感，导致其较早就发生形态结构的改变，本实验中早期糖尿病大鼠视网膜光镜及电镜检查均显示结构改变，主要集中在神经节细胞层、内核层及外核层，但程度相对较轻，未出现视网膜结构的严重紊乱，显示出视网膜神经元对缺氧极为敏感，糖尿病早期就可出现视网膜神经元结构的改变。而rhEPO干预组糖尿病大鼠视网膜结构接近正常，节细胞层未出现空泡变性等异常，从而显示rhEPO对早期糖尿病大鼠视网膜神经元具有保护作用。实验结果表明EPO对早期糖尿病大鼠视网膜神经细胞具有保护作用。

参考文献

[1]FrankRN.Diabeticretinopathy.NEnglJMed2004;350(1):48-58

[2]JoussenAM,MurataT，TsujikawaA,etal.Leukocyte-mediatedendothelialcellinjuryanddeathinthediabeticretina.AmJPathol2001;158(1):147-152

[3]YamashiroK,TsujikawaA,IshidaS,etal.Plateletsaccumulateinthediabeticretinalvasculaturefollowingendothelialdeathandsuppressblood-retinalbarrierbreakdown.AmJPathol2003;163(1):253-259

[4]BarberAJ,LiethE,KhinSA,etal.Neuralapoptosisintheretinaduringexperimentalandhumandiabetes.Earlyonsetandeffectofinsulin.JClinInvest1998;102(4):783-791

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[7]KrantzSB.Erythropoietin.Blood1991;77:419-434

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[9]CampanaWM,MisasiR,O′BrienJS.Identificationofaneurotrophicsequenceinerythropoietin.IntJMolMed1998;1(1):235-241