细胞和分子细胞遗传学技术

细胞和分子细胞遗传学技术

张亚丽

张亚丽（黑龙江省森工总医院150040）

【中图分类号】R394.2【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）19-0151-02

经典的细胞遗传学技术是指通过制备染色体标本，分析染色体数目和结构改变与人类疾病之间的关系。近代分子生物学技术与细胞遗传学技术相结合，形成了细胞和分子遗传学技术。其中比较成熟、具有实用价值的技术是：①荧光原位杂交；②比较基因组杂交。

1人外周血淋巴细胞染色体检测技术

人外周血淋巴细胞染色体检测属于经典的细胞遗传学技术。用作染色体分析的标本包括外周血、脐带血、羊水、胎盘绒毛组织和肿瘤组织等。外周血是应用最多的材料。其他组织样本染色体制备方法与制备人外周血淋巴细胞的方法基本类同，只是标本的处理和培养条件有所调整。

1.1基本原理

体外培养的外周血淋巴细胞，在植物凝集素(PHA)的刺激下转化成为能进行有丝分裂的淋巴母细胞；在秋水仙素(纺锤体抑制剂)作用下，淋巴母细胞有丝分裂停滞，从而获得处于有丝分裂中期的淋巴细胞染色体标本。

1.2基本操作程序

(1)取血3ml(空针用0.1～0.2ml肝素抗凝)。

(2)用7号针头向每瓶培养液(内装有5ml培养液)接种血液标本15～16滴，摇匀后，静置于37℃的隔水式恒温培养箱中培养72h。

(3)终止培养前3h，用7号针头向培养瓶中加入秋水仙素3滴(浓度为20μg/ml)并混匀。

(4)按以下程序制片。

①收集细胞：由培养瓶中吸取培养物10ml置于离心管中，离,l～,10min(1500～2000r/min)离心后，弃上清液，留下沉淀物。

②低渗处理沉淀物：向沉淀物中加入已预温(37℃)的KCI(0.075mol/L)8ml，充分吹打，以使细胞分散，并将离心管置于37℃水浴中20～30min。

③固定沉淀物：向每只离心管中加入新鲜配制的甲醇一冰醋酸(3：1)固定液1～2ml(预固定)，轻轻混匀后离心10min(2500r/min)，去上清液，留沉淀物；向每只离心管中再加上述固定液8ml，轻轻混匀后静置30min以上，离心10min(2500r/min)；然后，再重复固定、离心1次。

④制作标本片：尽量弃去离心管中的上清液，用吸管轻轻吹打其中的沉淀物，再加入6～7滴新鲜的固定液并混匀，然后，将该沉淀物滴加于已经预冷的载玻片上(预冷载玻片：将清洁载玻片放在盛有蒸馏水的小搪瓷盆中置于4℃冰箱中数小时以上)；将标本片晾干后，置于75℃烤箱中烘烤2.5h，然后自然冷却，也可将标本片吹干后用火焰烘干。

⑤标本片染色：用Giemsa染液(以pH7.4的磷酸缓冲液配制，1.10)染色10min，自来水冲净并晾干。

⑥显微镜观察：低倍镜下，选择标本片中染色体分散好、无细胞质背景、处于中期核分裂的培养细胞；然后，在高倍镜、油镜下观察染色体形态，进行计数、分组和性别鉴定；拍摄照片以进行正确的核型分析，并将典型图片存档。可根据需要进行染色体的Q显带、G显带、C显带、R显带和T显带。

1.3注意事项

PHA是体外细胞培养成败的关键因素，其应用浓度应根据各批号PHA的效价作适当调整。秋水仙素的浓度和作用时间影响标本的分析。浓度低或作用时间短，会使标本中的分裂细胞减少；浓度高或作用时间长，会使染色体过于缩短，以致形态特征模糊。采血和接种培养时，不要加入过多肝素，肝素过多可抑制淋巴细胞转化。显带检测，以存放3d左右的标本片效果较好。观察G显带时，检材要用胰酶液消化。消化液的配制和消化条件的控制要认真探索，以获得最佳结果。

2荧光原位杂交技术(FISH)

2.1基本原理

2.1.1原位杂交是用标记了已知序列的核苷酸片段作为探针，通过核酸杂交，直接在组织切片(冷冻切片或石蜡切片)、细胞涂片、染色体制备标本或培养细胞爬片上，检测或定位某一特定的目的DNA或目的RNA的存在。

2.1.2FISH是以荧光素标记已知序列的核苷酸片段(探针)，通过检测荧光来定性和定位目的核酸片段，具有敏感、快速、能同时显示多种颜色等优点，不但能显示中期核分裂象的染色体，还能检测间期细胞核的DNA。

(1)FISH的直接法：以荧光素直接标记DNA探针，特异性强，方法简便。随着荧光标记技术的改进，直接法的敏感性不断提高，是目前常用的方法。

(2)FISH的间接法：以非荧光素标记物标记DNA探针，再桥连一个荧光标记抗体。

2.2基本方法

2.2.1探针和试剂。用于FISH的探针有不同类型。已有商品化的探针用于FISH。avidin-FITC、anti-avidin和PI等检测试剂均可购得。

2.2.2原位杂交。杂交前标本和探针应经变性处理。

2.2.3检测。杂交后的标本除去封胶，置2×SSC中洗去盖片。经多步骤漂洗后依次在亲和素一荧光素、抗亲和素抗体和亲和素一荧光素中各孵育20min(生物素标记探针)，其间及其后各用1×PBD洗3次，每次2min。若用直接法FISH进行检测，后续免疫结合反应可省略，最后应加抗荧光衰变剂和DNA复染剂后封片。

2.3注意事项

实验室必须优化FISH操作过程的各项条件。整个杂交和杂交后检测过程要始终保持标本片的湿润，以防载玻片干燥后引起非特异性染色。复染时要避光。根据荧光染料的不同选择相关的荧光显微镜滤色片。

3比较基因组杂交(CGH)

3.1基本原理

将用不同颜色荧光素分别标记的被检细胞或组织(例如肿瘤组织)的DNA(被检组探针)和正常细胞或组织的DNA(正常组探针)按1：1的比例混合，然后与正常淋巴细胞核分裂中期的染色体进行原位杂交；进而根据原位杂交后两种探针不同颜色荧光强度的比较，判断被测细胞或组织基因组相对DNA拷贝数的变化(增加或缺失)。目前主要用于肿瘤研究。

3.2基本方法

3.2.1DNA的提取和标记。

3.2.2已被标记的DNA探针与正常中期染色体进行原位杂交。

3.2.3荧光显微镜检查，数字化图像显示沿各染色体纵轴产生的绿红荧光密度比率，分析各对应区域的拷贝数变化。

3.3应用

分析肿瘤基因组热点拷贝数目的异常。分析编码基因及其与肿瘤发生、发展、诊断、分类和预后的关系。

3.4注意事项

为使检测结果具有可比性，应一次制备大量正常中期染色体的标本片，以保证整个实验使用同一批标本片。高质量地提取具有代表性的DNA。CGH所能检测到的DNA最小增加量或最小缺失量是3～5Mb，因此，小片段的拷贝数变化会被漏检。CGH不能检出染色体平衡结构重排和多倍体异常。

参考文献

[1]申咏梅,薛永权,李建勇,过宇,潘金兰,吴亚芳.间期荧光原位杂交检测骨髓增生异常综合征-5/5q-染色体异常[J].中华血液学杂志.2001年10期.

[2]李建勇，马力，肖冰，潘金兰，仇海荣，吴亚芳，温丙昭，薛永权.多色荧光原位杂交技术检测急性淋巴细胞白血病复杂核型异常[J].中国实验血液学杂志.2006年01期.

[3]薛永权,申咏梅.染色体检测在骨髓增生异常综合征诊断中的意义[J].中国实用内科杂志.2002年01期.