使用荧光检测法替代MTT检测法进行抗癌药物筛选的可行性

使用荧光检测法替代MTT检测法进行抗癌药物筛选的可行性

吴春扬吴风娟李大伟

吴春扬吴风娟李大伟（上海交通大学药学院上海闵行200240）

【摘要】我们提出一种新型的基于体外细胞株增殖抑制的药物筛选方法，该方法使用了绿色荧光蛋白(GFP)，既简单又省时可靠。我们的实验数据显示，使用绿色荧光蛋白的结果比MTT测定法更加一致可靠。我们的数据还证实了新的检测方法在细胞生长曲线的灵敏度和精度、抗癌药物的抑制作用、剂量反应。

【关键词】体外细胞株药物筛选EGFPMTT

【中图分类号】R979.【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）11-0032-03

药物筛选是药物研发领域中的主要方法。可靠性和有效性是评价药物筛选方法好坏最重要的两个指标。目前，MTT法已经成为一种被广泛使用的检测细胞增殖抑制的标准方法[1]。这个经典细胞增殖检测方法的可靠性和灵敏度取决于很多因素，存在的一些易出错步骤也为其他更有效、更可靠、更方便的药物筛选方法提供了足够的发展空间[2]。

在本文中，我们研发了一种简单的基于体外细胞株的荧光检测法，获得使用稳定转染U2OS-EGFP细胞的细胞成活率。运用此方法，我们可以通过测量细胞裂解物的绿色荧光来确定细胞增殖或抑制的情况，因为细胞裂解物的荧光读数直接反映了成活细胞的个数[3]。EGFP中的绿色荧光(GF)，激发主峰值在488nm，发射主峰值在507nM，和其他绿色荧光蛋白相比有更长的半衰期[4]。

一实验材料和方法：

MTT溶液（5mg/ml用磷酸缓冲液(PBS)配制，pH=7.4)，DMSO购买自Sigma-Aldrich化学品有限公司（St.Louis,MO），由杜尔贝科改良的鹰培养基（DMEM）购买自Gibco(GrandIsland,NY)，胎牛血清（FBS），NP40细胞裂解缓冲液购买自Sigma。阿霉素，戊烷脒。所有的药品和化合物均溶解于DMSO中。1%的DMSO常被用于药物筛选方法的样本管理，因为大多数细胞培养基能溶解于这个浓度[5]。

二培养稳定的U2OS-EGFP细胞株(UGFP-DK1)

U2OS细胞是由pEGFP-N1感染病毒核酸的细胞株质体放在24单元格培养皿中培养。在感染病毒核酸后的24小时内细胞株就被转移到10厘米培养皿中培养2周培养基中含有400μg/毫(,)升G418为主的培养液辅以增加10%胎牛血清(,)和1%的抗生素(购自北京Solarbio科学和技术(,))，每隔2-3天更换一次培养基。通过对受感染细胞株稳定增殖过程中选择和测量不同浓度细胞的荧光度。我们选择高荧光度增殖细胞用作药物筛选。U2OS-EGFP4F12G细胞株(UGFP-DK1)被选为药物筛选细胞株。

三绿色荧光检测

一开始在DMEM中培养UGFP-DK1，细胞培养基辅以10%胎牛血清、1%抗生素，培养至观察到生长阶段（至少2代，每次有80%的细胞融合）。这些细胞使用胰蛋白酶缓冲进行胰蛋白酶化，期间需要对细胞计数并更换新鲜的培养基。然后使用多通道移液管移将细胞移进入96单元格培养皿中(一般为3×103个细胞/单元格,除非另有说明)，每个单元格拥有200μl培养基(重复3-5次)。在37℃及5%CO的恒定环境中培养4到6个小时。当细胞已经附在培养皿壁上，原有培(2)养液被吸走，选择一定浓度的药物（化合物）和溶媒介质(用DMSO来控制)混合在培养基中(事先准备好)进行替换，然后继续在37℃及5%CO2恒定环境中进行培养。在选择培养好的细胞株后，培养基被完全吸走，加入150μl溶菌液(1%NP-40)进行补充。将培养皿振荡20分钟。从培养皿的每个单元格中取100μl溶菌后的细胞转移到96单元格的白色条板中。用激发主波长为488纳米、发射主波长为507纳米、频带宽度为5的酶联免疫吸附测定仪测定萤光度。裂解缓冲液被用做对细胞荧光度的抑制作用。所有不同药物浓度测试需要对每一块培养皿重复测试3-5单元格。

四MTT法检测

细胞株的培养要增殖两代，每次细胞的融合度要达到有80-90%。等细胞重复在新鲜的培养基中培养并胰酶蛋白化后用多通道移液管将细胞移至体积为200μl微量滴定盘中，微量滴定盘具(,)有96单元格，每单元格有3000-5000个细胞。培养盘在37℃的恒定环境中培养4-6小时,使细胞贴壁。然后吸走原培养基，加入事先准备好的含有一定浓度药物的培养基200μl。这些细胞在37℃及5%CO2的恒定环境中培养。在药物暴露前4小时加入20μl的MTT溶液。当药物暴露结束时加入150μlDMSO溶液使细胞的酶反应停止。将盘子振荡15分钟后用550纳米波长测量细胞外径。所有不同药物浓度测试需要对每一块培养皿重复测试3-5单元格。控制要求每个培养单元格中有培养基，每个单元格中的细胞都在DMSO培养液中。

五实验数据分析

所有数据均表示为平均数x-±SD。差异的意义由学生的t-test结果确定。P<0.05被认为有显著不同。所有数据的计算使用了GraphPadPrism.软件。

六结论

1、比较生长曲线

首先，比较MTT法和绿色荧光法的细胞增殖测量。我们分别使用MTT法和绿色荧光法培养UGFP-DK1细胞，并绘制出上述两种方法下的细胞生长曲线。我们在天第0天，第1天，第2天和第3天采集读数并绘制成（图1）。第0天的读数是在细胞贴附后记录的。两种方法均能产生可比较的生长曲线。绿色荧光法的实验结果显示和第0天相比，细胞数有了显著的增长，错误也更少。使用MTT法的U2OS细胞的生长曲线是类似的。（数据未显示）

图1：UGFP-DK1细胞的生长曲线是通过使用两个不同的检测方法，即荧光法检测（A）和MTT法检测(B)测得的。这些数字说明，第0天-3天从细胞生长的发现有类似。图(C)和(D)显示分别使用绿色荧光和MTT对第0天测的单元格数目加倍。误差线代表标准错误的n=5的值。

图2：图所示由0.2μg/ml阿霉素(.)和基质（■）对细胞增殖的抑制作用超过四天。荧光检测（A）和MTT法检测(B)产生了类似的结果。在浓度分别为1μg/ml(.)、0.2μg/ml(■)、0.02μg/ml(▲)、0.01μg/ml(▼)、0.002μg/ml(.)阿霉素和基质(○)中；绿色荧光检测(C)和MTT检测(D)的结果是也是相似。误差线代表标准错误的n=5的值。

2、绿色荧光法检测药物反应

一个有效的筛选模型，不仅要能计算细胞的生长曲线还要能显示药物反应浓度和时间上的较大差异。本实验中我们使用一种标准的抗癌药物阿霉素（Doxorubicin）进行实验。首先在同等浓度下使用不同的时间梯度，然后在特定的时间点使用不同的浓度梯度。在这两个实验中，我们的荧光法对阿霉素的抗增殖活性产生了明显差异。而MTT法在相同的实验中，结果相似，并未有大的差异（图2）。

3、荧光法检测的优点

为了确保筛选检测工作或实验数据的一致性，必须对检测方法进行优化。荧光法检测系统优化了检测需要的细胞数和时间间隔。要确定荧光度的细胞数的对应关系，需要制定UGFP-DK1细胞株的标准曲线。我们将50000细胞接种在96单元格培养皿的第一行单元格中，后面几行依次稀释（后面每行单元格中的细胞数是前面的一半)直到接种到第12行。细胞被培养一整夜后并测定他们的荧光度(图3）。48小时后的测定结果显示，在未经处理的单元格中的细胞对高浓度和低浓度药物反应后测得的荧光度差异显著（图4）。

图3：最佳测定时间，分别在24小时和48小时对使用0.2μg/ml()和1μg/ml()的阿霉素和基质()进行测定。48小时测定获得较好的效果。误差线代表标准错误的n=5值。p值对应基质（＊）和0.2μg/ml药品(#)*/#p<0.05,**p<0.01,***/###p<0.001

八讨论

由于药物筛选是新药研发领域最重要的步骤之一。在本文中，我们描述了我们使用新荧光法的细胞筛选系统进行抗癌药物筛选。我们称这种测定方法为UGFP-DK1检测法或缩写“绿色荧光蛋白(GFP)检测”。我们证明了这种测定方法的简单、有效、可靠。与被广泛使用的标准检测方法-MTT相比，我们用新的基于荧光法的检测系统得到了相同的结果，但错误要少得多。我们实验室中抗癌化合物的小尺度药物筛选由我们荧光法测定，每次重复的实验结果是一致的，证明我们新测定检测系统的可靠性。

参考文献

[1]MosmannT.Rapidcolorimetricassayforcellulargrowthandsurvival:Applicationtoproliferationandcytotoxicityassays.Journalofimmunologicalmethods,1983.65(1-2):p.55-63.

[2]SkehanP,StorengR,ScudieroD,MonksA,McMahonJ,VisticaD,etal.Newcolorimetriccytotoxicityassayforanticancer-drugscreening.JNatlCancerInst,1990.82(13):p.1107-1112.

[3]KainSR.Greenfluorescentprotein(gfp):Applicationsincell-basedassaysfordrugdiscovery.DrugDiscovToday,1999.4(7):p.304-312.

[4]ShanerNC,SteinbachPA,TsienRY.Aguidetochoosingfluorescentproteins.NatMethods,2005.2(12):p.905-909.

[5]WangX,GeJ,WangK,QianJ,ZouY.Evaluationofmttassayformeasurementofemodin-inducedcytotoxicity.Assayanddrugdevelopmenttechnologies,2006.4(2):p.203-207.