非发酵豆制品微生物快速检测技术研究

非发酵豆制品微生物快速检测技术研究

周帷

周帷（广东省食品药品检验所510180）

【摘要】目的食源性微生物常规检验方法操作繁琐、耗时长，拟建立非发酵豆制品致病性微生物应急快速检测方法。方法利用免疫检测技术、荧光定量PCR方法、全自动细菌鉴定系统、快速测试片法等对食品中常见的致病菌进行定量、定性研究以及验证试验。结果快检方法与常规方法在检验数据结果上一致，并能大大缩短实验时间，减少工作量，提高工作效率。结论快检方法敏感、特异、简便、快速，用于非发酵豆制品微生物污染情况的快速判断和大批量筛选食品中控制菌是合理可行的。

【关键词】非发酵豆制品微生物快速检测

【中图分类号】R319【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）10-0032-04

非发酵豆制品是指以大豆或其他杂豆为原料制成的豆腐，以及经卤制、炸卤、熏制、干燥的豆制品。营养丰富，口感细腻，食用方便，深受广大消费者的喜爱。但根据国家质检总局及各地市公布的对非发酵性豆制品的抽查结果显示[1][2][3]，近半数非发酵性豆制品微生物超标。细菌总数及致病菌是评价食品被细菌污染程度的重要指标，人如果食用了微生物超标的食品，易引起肠胃不适、腹泻等症状，严重的更可危及生命安全。

食物中毒的特点是潜伏期短、发病急剧、爆发性、相似性。利用传统的检测方法，主要包括形态检查和生化方法，涉及的实验较多、操作繁琐、需要时间较长、准备和收尾工作繁重,而且要有大量人员参与。不能快速的得到检测结果并有效地提出防治措施。

本文针对各级监管部门的技术需求，利用免疫检测技术、荧光定量PCR方法、全自动细菌鉴定系统、快速测试片法等对食品中常见的致病菌进行定量、定性研究以及验证试验，拟建立非发酵豆制品致病性微生物应急快速检测方法。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1样品采集

按照随机采样原则，利用无菌操作技术，在便利超市、酒店餐厅和集贸市场进行采样，共计采集21份样品。采样量≥250g/份，于4℃下，4～6h送至实验室检测。

1.1.2仪器与试剂

杜邦BAXsystemQ7全自动病原微生物检测系统，梅里埃miniVIDAS全自动免疫荧光检测系统，梅里埃VITEK2COMPACT全自动微生物分析系统，生化培养箱，生物安全柜等。

MiniVIDAS沙门氏菌试剂盒，VITEK2COMPACT试卡及试剂购自广州千江实验技术有限公司；BAXsystemQ7金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌试剂盒购自广州海滔科学仪器有限公司；志贺氏菌荧光定量PCR检测试剂盒（引物、探针见SN/T1870-2007）购自广州宸源生物科技有限公司；其余各种培养基和生化试剂均购自广东环凯生物制品有限公司；以上各种培养基、试剂均在有效期内使用。

1.1.3质控菌株

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）CMCC(B)26003

沙门氏菌（Salmonella）CMCC(B)50094

志贺氏菌（Shigellasonnei）CMCC(B)51592

所有增菌液、分离平板以及试剂均用已知阳性菌株与样品同时进行检测,以校验培养基质量和质量控制。

1.2方法

1.2.1检验项目与方法

菌落总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌检测按照按国家标准GB/T4789.23《食品卫生微生物检验冷食菜、豆制品检验》。MiniVIDAS，BAXsystemQ7，VITEK2COMPACT，检验测试片的操作按生产厂家规定的操作方法程序执行。按国家标准GB2711-2003《非发酵性豆制品及面筋卫生标准》进行评价。

1.2.2检样的处理

以无菌操作称取25g检样，放入225ml灭菌蒸馏水或各稀释液，用均质器打碎1min，制成混悬液。定型包装样品，先用75%酒精棉球消毒包装袋口，用灭菌剪刀剪开后以无菌操作称取25g检样，放入225ml无菌蒸馏水，用均质器打碎1min，制成混悬液。

1.2.3菌落总数

常规培养法：将混悬液10倍系列稀释；选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液，各取1ml分别加入无菌培养皿内。每皿中加入15mL～20mL平板计数琼脂培养基，混匀。36℃培养48h；计算菌落总数。

3M细菌总数测试片：将混悬液10倍系列稀释；选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液。将测试片置于平坦表面处，揭开上层膜。使用吸管将1mL样液垂直滴加在测试片的中央处。将上层膜缓慢盖下，使用压板隆起面底朝下，放置在上层膜中央处。轻轻的压下，使样液均匀覆盖于圆形的培养面积上。拿起压板，静置至少1m以使培养基凝固。36℃培养48h。

1.2.4大肠菌群

常规培养法：将混悬液10倍系列稀释；选择适宜3个连续稀释度的样品匀液，其中10-1取10ml加至3管双料胆盐乳糖发酵管，10-1和10-2分别各取3ml加至3管单料胆盐乳糖发酵管。一共做9管。36℃培养24h。将产气的发酵管分别接种EMB平板，36℃培养18-24h。挑取可疑大肠菌群菌进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，36℃培养24h，产气者且为革兰氏阴性无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。根据阳性管数，查MPN表，得出MPN值。

3M大肠菌群快速检验测试片：将混悬液10倍系列稀释；选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液。将测试片置于平坦表面处，揭开上层膜。使用吸管将1ml样液垂直滴加在测试片的中央处。将上层膜缓慢盖下，避免有气光泡产生。使用压板（平面底朝下）放置在上层膜中央处。轻轻的压下，使样液均匀覆盖于圆形的培养面积上。拿起压板，静置至少1分钟以使培养基凝固。36℃培养24h。

1.2.5金黄色葡萄球菌

常规培养法：取25g检样，放入225ml7.5%氯化钠肉汤，均质。36℃培养18h～24h；分别划线接种到Baird-Parker平板和血平板。血平板36℃培养18h～24h，Baird-Parker平板36℃培养18h～24h或45h～48h。挑取典型菌落进行革兰氏染色镜检及血液凝固酶等试验。

BAXsystemQ7法检测步骤：取25g检样，放入225ml7.5%氯化钠肉汤，均质。37℃培养22h～24h。混合裂解液和蛋白酶（按单个样品200μL+2.5μL），200μL/管，分装到裂解管中。取待测细菌增菌液5μL加入裂解管中，盖上盖子，用压盖器压紧。加热裂解管，55℃，60min。再次加热，95℃，10min。冷却裂解管，4℃放置5min。取出PCR药片管，开盖器开盖。取出冷却的裂解管，吸出30μL混合液，沿PCR药片管壁加入，盖上配套的盖子，压盖器压紧。上BAXsystemQ7进行检测，按规定的操作指南进行，90min后完成测定。

1.2.6沙门氏菌

常规培养法：取25g样品，放入225mlBPW中，均质；36℃培养8～18h。以上增菌液各取1mL转种到2种增菌液：（1）四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB)，42℃培养18～24h。(2)亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC)，36℃培养18～24h。将增菌液取1环划线接种于BS琼脂平板和XLD琼脂平板，XLD琼脂平板36℃培养18～24h,BS平板36℃培养40～48h。挑选可疑菌落进行三糖铁琼脂、H2S、靛基质、pH7.2尿素、氰化钾（KCN）、赖氨酸脱羧酶等项目的生化试验。

miniVIDAS法检测步骤:前增菌：取25g样品加入225ml缓冲蛋白胨水中，混匀，35℃孵育24h。增菌：孵育后，取1ml前增菌悬液加入10ml四硫磺酸盐肉汤中，42℃孵育6h。同时取0.1ml前增菌液加入10ml亚硒酸盐-胱氨酸肉汤。35℃孵育6h。后增菌：孵育后，从亚硒酸盐-胱氨酸肉汤取1ml加入10mlM肉汤，从四硫磺酸盐肉汤中取1ml加入10mlM肉汤。再孵育亚硒酸盐-胱氨酸肉汤和四硫磺酸盐肉汤24h。孵育两份M肉汤42℃18h。孵育之后，从两份M肉汤中各取1ml肉汤加入一个试管，100℃水浴15min，冷却后取0.5ml上miniVIDAs进行检测，按规定的操作指南进行，45min后完成测定。

其余的M肉汤、亚硒酸盐-胱氨酸肉汤和RappaportVassiliadis肉汤4℃储存，以备对阳性标本的复查。阳性结果的确证：将保存于2-8℃的增菌肉汤（亚硒酸盐-胱氨酸肉汤和四硫磺酸盐肉汤）和M肉汤转种至专用的琼脂平板（HEKTOEN，XLD或硫酸铋），孵育后对可疑菌落进行确证。

BAXsystemQ7法检测步骤：取25g检样，放入225ml缓冲蛋白胨水，均质；37℃培养18h。取10μL加至500μLBHI肉汤中，37培养3h。混合裂解液和蛋白酶（按单个样品200μL+2.5μL），200μL/管，分装到裂解管中。取待测细菌增菌液5μL加入裂解管中，盖上盖子，用压盖器压紧。加热裂解管，37℃，20min。再次加热，95℃，10min。冷却裂解管：4℃放置5min。取出PCR药片管，开盖器开盖。取出冷却的裂解管，吸出50μL混合液，沿PCR药片管壁加入，盖上配套的盖子，压盖器压紧。上BAXsystemQ7进行检测，按规定的操作指南进行，3.5h后完成测定。

1.2.7志贺氏菌

常规培养法：取25g检样，放入225mlGN增菌液，均质。36℃培养6h～8h，分别取1环划线接种到HE琼脂平板和麦康凯琼脂平板，36℃培养18h～24h。挑选可疑菌落进行葡萄糖铵、西蒙氏柠檬酸盐、赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶、pH7.2尿素、氰化钾（KCN）、水杨苷和七叶苷分解等项目的生化试验。

实时PCR法：按SN/T1870－2007《食品中致病菌检测方法实时PCR法》，取25g检样，放入225mlGN增菌液，均质；36℃培养24h。从增菌液取1mL加到1.5mL离心管中，离心取上清，加入50μLDNA提取液，混匀后水浴，离心取上清，制备得增菌液模板DNA。反应体系体积为25μL：按标准规定量加入PCR缓冲液、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶、水、模板DNA。反应条件：37℃，5min，95℃预变性3min，94℃变性5s，60℃退火延伸40s，同时收集FAM荧光，进行40个循环，4℃保存反应产物。按标准判断结果。

1.2.8VITEK2COMPACT鉴定

将上述检测分离得到的阳性菌株通过VITEK2COMPACT进行鉴定。用分液器取3ml盐水到试管，挑取阳性菌落使均匀分散到盐水，试管插入比浊中，读数应在规定范围（GN和GP为0.5～0.63）。将配好的菌液放在试卡架上，取出鉴定卡将弯管插入试管，放在试卡架上。打开充填舱门，放入试卡架，关闭舱门，开始充填，等待充填舱指示灯闪烁，打开充填舱门，取出试卡架。打开上载舱门，放入试卡架，按规定的操作指南进行剩余鉴定步骤，约4h后完成测定，给出鉴定结果。

2结果

2.1菌落总数和大肠菌群的检测情况

21份样品按1.2.3和1.2.4方法进行检测，结果见下表1。按国家标准GB2711-2003中微生物指标进行判定，菌落总数合格率为57.1%，大肠菌群合格率为28.6%，两项均合格的合格率为19%。其中14份散装非发酵豆制品菌落总数合格率为57.1%，大肠菌群合格率为7.1%，两项均合格的合格率为7.1%。而7份定型包装非发酵豆制品菌落总数合格率为57.1%，大肠菌群合格率为71.4%，两项均合格的合格率为42.8%。对结果中菌落总数两种检测方法使用统计学方法分析，结果无差异（P=0.96）。

表1常规法和测试片法检测各样品菌落总数和大肠菌群的结果

2.2控制菌的检测情况

21份样品按1.2.5、1.2.6和1.2.7的方法进行金黄色葡萄球菌，沙门氏菌，志贺氏菌的检测。检出金黄色葡萄球菌阳性2份，检出率为9.5%；沙门氏菌阳性1份，检出率为4.8%；志贺氏菌未检出（阳性对照组可检出，证明方法可行）。阳性样品均由散装非发酵豆制品检出，定型包装非发酵豆制品未检出，常规方法与快检方法同时进行，结果一致。将分离得到的菌株进行VITEK2COMPACT鉴定，结果可靠。不同致病菌检出率差异有统计学意义（P<0.05），各检测项目合格率结果见下表2。

图1各检测项目合格率比较

2.2常规法与快筛快检方法所需最少实验时间的比较

根据1.2方法中不同检测项目的实验方法，结合实际操作，计算在理想情况下完成各方法所有操作获得实验结果所需的最短时间，结果如下表3。可见快筛快检方法大大缩短实验时间，可快速获得实验结果。各检测项目差异具有统计学意义（P<0.05）。

表3各检测项目最短实验时间的比较

3讨论

3.1快速检测法的优势

3.1.1快速测试片（Petrifilm）法

3M快速测试片法得到包括AOAC，AFNOR在内的国际权威机构的认证，在全球许多国家也已获得官方机构的正式批准，从而可以确保检测结果的可靠性和在世界各地的广泛认可。

虽然菌落总数检测中常规法和快检法需时一样，但由于食品微生物检验往往样品量大及检验时限短，故测试片法可减少实验前制备培养基等大量的准备工作，减少工作量，提高工作效率。并克服了传统的测试方法存在的由于使用不同批次的培养基，不同的配制条件，不同配制人员而导致的差异性。

大肠菌群检测项目由于非发酵豆制品所用微生物检验标准中该项目需按2003版国标检验，故常规法和快检法的检验结果单位并不一致，但从表1结果可以看出趋势，要符合标准中大肠菌群的规定限度，快速测试片上要无菌落生长或只有个别菌落生长。而测试片法所需时间短，24h可出结果。故即使判断标准需按国标要求，实验也可以同时进行测试片法，根据测试片法的结果准备好伊红美蓝琼脂平板和乳糖发酵管所需的数量。可以有的放矢，在更短的时间内获得样品的测试结果，能更加迅速地采取有效的措施解决发现的问题

经统计学表明与国标法相比无显著差异（P=0.96），纸片法检出率较国标法高。这结果与国内研究相一致[4]。

3.1.2控制菌的快筛快检方法

传统的控制菌检测方法，主要包括形态检查和生化方法，其涉及的实验多、操作繁琐、需要时间长、准备和收尾工作繁琐,需要较多人力参与，因此不能快速得到检测结果并有效地提出防治措施。

图3快速检验流程图

例如，沙门氏菌是引起食物中毒的主要病原菌之一。食品中沙门氏菌检测的标准培养方法耗时长，阴性结果的确认需要五天的时间。而使用免疫检测技术（miniVIDAS）和荧光定量PCR技术（BAXsystemQ7）可大大简化该实验并缩短时间。

这两种快检方法检测的特点是只要细菌存在于增菌培养基，不需纯培养，即可检出，而常规培养法需要被检细菌为纯培养，并在检验过程中从分离培养基上挑取的可疑菌落数量不足有可能导致假阴性的结果。VIDAS法比常规法至少可提前2～3d获得结果，节约大量的试剂和器皿[5]。而使用荧光定量PCR的方法，增菌时间更短，也不需要像VIDAS法那样进行前增菌和后增菌，故可将检测时间进一步缩短，最快仅需27h就能判断出样品是否收到沙门氏菌的污染，比传统方法提前4d。

本研究针对同一样品同时进行常规方法与快检方法，结果一致。并用实验菌株对2种方法进行测试比较，所获结果完全一致未见异常。通过对实际样品的检测，表明该方法对于控制菌阳性样品未存在漏检，同时对于阴性样品也未出现假阳性结果，说明该方法检测特异性较高，方法可行[6]。

从此实验可得出快检方法敏感、特异、简便、快速，用于非发酵豆制品控制菌污染情况的快速判断和大批量筛选食品中控制菌是合理可行的。

3.2存在问题及发展方向

3.2.1应用快速测试片（Petrifilm）技术检测菌落总数和大肠菌落数可减少实验前制备培养基等大量的准备工作，减少工作量，提高工作效率。但当测试片上菌落较多时，菌落过于密集出现蔓延的情况。特别是大肠菌群测试片，当菌落数值很高时，白色背景会由于菌落过多蔓延成粉红色，准确计数较困难。今后可通过预实验摸清样品的污染程度，从适当的稀释级开展实验。

3.2.2由于BAXsystemQ7全自动病原微生物系统暂无志贺氏菌的检测试剂盒，故志贺氏菌的PCR技术快检方法的前期工作需自行按SN/T1870－2007标准合成引物和模板，此工作可在开展志贺氏菌检验前进行准备，且引物和模板可保存并多次使用。但由于标准推荐引物和模板在不同实验条件下会有一定差异，故可在以后的工作逐步摸索更适合更高效的引物和模板。

3.3快速检验流程

根据上述的实验结果，可将非发酵豆制品快速检验流程图归纳如图3。

参考文献

[1]2010年邵阳市非发酵性豆制品卫生状况调查.科技信息,2010年18期:365

[2]2007年深圳福田区非发酵性豆制品吊白块检测结果分析.海峡预防医学杂志,2008年第14卷第3期:60-61

[3]2007年郑州市中原区豆制品卫生检测结果分析.河南预防医学杂志,2008年第19卷第4期:301-302

[4]食品中细菌总数快速检测技术的研究进展.食品研究与开放,2010.12,第31卷第12期:276－280

[5]2种方法检测食品中沙门菌的实验研究.预防医学论坛,2010.4,第16卷第4期:343－344

[6]3类食品中沙门氏菌PCR快速检测方法的建立..现代农业科技,2010年第23期:324－325