济南市莱芜区产ESBLs肺炎克雷伯菌氨基糖苷类耐药基因的检测分析

济南市莱芜区产ESBLs肺炎克雷伯菌氨基糖苷类耐药基因的检测分析

孙元振1亓然1张志军2

孙元振1亓然1张志军2

（1济南市第二妇幼保健院山东济南271100）

（2泰安市中心医院山东泰安271000）

【摘要】目的：了解我区临床分离的产ESBLs的肺炎克雷伯菌中，氨基糖苷类耐药基因的存在情况。方法：采用WalkAway96PLUS细菌鉴定及药敏分析仪对临床分离的产ESBLs的肺炎克雷伯菌进行细菌鉴定和药敏实验。用PCR法检测氨基糖苷类耐药基因，并对阳性基因扩增产物进行测序验证。结果：52株肺炎克雷伯菌中，26株（50.0%）acc（6’）-Ⅰb基因阳性，12株（23.1%）ant（3’’）-Ⅰ基因阳性，10株（19.2%）ant（2’’）-Ⅰ基因阳性，4株（7.7%）acc（3）-Ⅳ基因阳性和2株（3.8%）arm-A基因阳性。结论：院内临床分离产ESBLs的肺炎克雷伯菌氨基糖苷类耐药基因携带率较高，以acc（6’）-Ⅰb、ant（3’’）-Ⅰ、ant（2’’）-Ⅰ、acc（3）-Ⅳ和arm-A为主。

【关键词】ESBLs；肺炎克雷伯菌；氨基糖苷类；耐药基因

【中图分类号】R446.5【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2019）05-0027-03

DetectionofaminoglycosideresistancegenesinESBLsproducingKlebsiellapneumoniaeinahospital

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheprevalenceofaminoglycosideresistancegenesinESBLsproducingKlebsiellapneumoniaeisolatedinourhospital.MethodsBacterialidentificationandantimicrobialsusceptibilitytestingofESBLsproducingKlebsiellapneumoniaewereperformedbyautomatedmicrobiologyanalyzerWalkAway96PLUS.AminoglycosideresistancegenesweredetectedbyPCR,andportionofpositivegenesweresequenced.ResultsAmongthe52strainsKlebsiellapneumoniae,26strains(50.0%)weretestedacc(6’)-Ibgenes,12strains(23.1%)weretestedant(3’’)-Igenes,10strains(19.2%)weretestedant(2’’)-Igenes,4strains(7.7%)weretestedacc(3)-IVgenesand2strain(3.8%)weretestedarm-Agenes.ConclusionsTheratesofaminoglycosideresistancegenesinESBLsproducingKlebsiellapneumoniaeisolatedfromclinicwereveryhigh,mainlyaboutacc(6’)-Ib,ant(3’’)-I,ant(2’’)-Igenes,acc(3)-IVandarmAgenes.

【Keywords】ESBLs;Klebsiellapneumoniae;Aminoglycoside;Resistancegenes.

肺炎克雷伯菌是临床感染性疾病和医院感染中常见的病原菌。2017年CHINET中国细菌耐药性检测报告显示，肺炎克雷伯菌的分离率位居第二位，与此同时，肺炎克雷伯菌每年的分离率亦呈稳步上升趋势[1]。氨基糖苷类抗菌药物因其对革兰氏阴性菌的杀菌作用，以及与β内酰胺类抗菌药物联合应用等诸多优势得到了广泛的开发与应用，但随之产生的细菌耐药问题日益严重。研究发现细菌对氨基糖苷类抗菌药物的耐药机制主要包括：氨基糖苷类抗生素修饰酶，核糖体16SrRNA以及细菌细胞膜外排泵的表达[2]。为探讨肺炎克雷伯菌氨基糖苷类耐药基因的表达情况，本研究收集临床分离的产ESBLs的肺炎克雷伯菌，检测分析9种氨基糖苷类修饰酶基因和2种16SrRNA基因，现将结果报道如下。

1.资料与方法

1.1菌株来源

收集2018年1月至2018年10月济南市第二妇幼保健院及莱芜区内其他5家综合医院临床分离出的52株产超广谱β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌（剔除重复菌株）。

1.2方法

1.2.1细菌鉴定及药敏试验采用WalkAway96PLUSNC61复合板鉴定菌种及进行药敏试验，用纸片扩散法复核药敏结果。并根据美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）2017年版要求进行抗菌药物敏感性判读[3]。

1.2.2耐药基因检测采用PCR法，用煮沸法提取制备DNA模板。PCR反应体系（总体系50μl）：上下游引物各1μl、Tag酶0.5μl、10×Buffer5μl、dNTP4μl、DNA模板2μl、ddH2O36.5μl。PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，40个循环，72℃保温10min。扩增产物在含2%溴化乙锭的琼脂糖凝胶中进行DNA电泳，用凝胶成像系统观察电泳结果。引物序列信息见表1。

1.2.3DNA测序随机取部分阳性基因进行测序，PCR产物送上海桑尼生物科技有限公司进行测序，结果进行BLAST序列比对分析。

2.3氨基糖苷类耐药基因序列分析结果

所得阳性扩增产物测序结果经BLAST比对分析，与目的基因相同。

3.讨论

肺炎克雷伯菌是院内感染的常见病原菌之一。我院细菌耐药性检测报告显示，近几年肺炎克雷伯菌的分离率一直稳居第二位。目前，氨基糖苷类抗菌药物联合β内酰胺类抗菌药物被广泛应用于肺炎克雷伯菌引起的感染中。由于泛用和过度使用随之产生的耐药问题随之凸显。研究发现，产ESBLs肺炎克雷伯菌不仅对头孢三代和氨曲南耐药，而且对氨基糖苷类、喹诺酮类和磺胺类呈交叉耐药。本研究选取我区2018年1月至2018年10月临床分离的52株产ESBLs的肺炎克雷伯菌对其11种氨基糖苷类耐药基因进行报道研究。

氨基糖苷类修饰酶的表达和氨基糖苷类抗菌药物作用靶位16SrRNA基因突变是细菌对氨基糖苷类抗菌药物产生耐药的主要机制[4]。前者通过修饰酶对氨基糖胺类抗菌药物结构进行修饰。使其无法作用于细菌产生耐药性。氨基糖苷修饰酶又根据其对2-脱氧链酶胺上-OH或-NH2催化作用的不同分为乙酰基转移酶类（AACs）、腺苷酰转移酶类（ANTs）及磷酸转移酶类（APHs）[5]。外源性16SrRNA甲基化酶主要通过修饰30s核糖体亚基N7-G1405及N1-A1408位，使细菌对氨基糖苷类抗菌药物产生较高耐药性[6]。

本研究药敏结果显示：52株产ESBLs的肺炎克雷伯菌对头孢噻肟、头孢曲松和头孢吡肟全部耐药，对三种氨基糖苷类抗菌药物庆大霉素、妥布霉素和阿米卡星的耐药率分别为53.8%（28/52）,30.8（16/52）和7.7（4/52）。说明产ESBLs肺炎克雷伯菌确实存在头孢类抗菌药物与氨基糖苷类抗菌药物的交叉感染，且阿米卡星的敏感性要明显高于庆大霉素和妥布霉素，因此在需要联合氨基糖苷类抗菌药物治疗产ESBLs肺炎克雷伯菌感染时应首选阿米卡星。

耐药基因结果显示：52株菌株中36株氨基糖苷类修饰酶基因基因阳性，检出率为69.2%，2株甲基化酶基因阳性，检出率为3.8%。共检出4种氨基糖苷类修饰酶基因：acc（6’）-Ⅰb、ant（3’’）-Ⅰ、ant（2’’）-Ⅰ和acc（3）-Ⅳ，阳性率分别为50.0%，23.1%，19.2%和7.7%；1种16sRNA甲基化酶基因：arm-A阳性率为3.8%。说明产ESBLs肺炎克雷伯菌产生氨基糖苷类修饰酶是介导氨基糖苷类耐药的主要途径，乙酰基转移酶（AACs）和腺苷酰转移酶（ANTs）是主要的两种表达形式。产生耐药的主要基因型为acc（6’）-Ⅰb、ant（3’’）-Ⅰ、ant（2’’）-Ⅰ和acc（3）-Ⅳ。同时产ESBLs肺炎克雷伯菌也可通过armA外源性甲基化酶修饰核糖体对氨基糖苷类抗菌药物产生耐药。

综上所述，我区临床分离的产ESBLs的肺炎克雷伯菌，氨基糖苷类耐药基因携带率高，且包含多种氨基糖苷类修饰酶基因和16SrRNA甲基化酶基因。医院应进一步加强消毒和监控，防止耐药株的流行和散播，同时各临床医师在实际诊疗工作中宜结合病人相关病情和药敏结果，参照相关的规范和指南合理使用抗菌药物。

【参考文献】

[1]胡付品,郭燕,朱德妹,等.2017年CHINET中国细菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志,2018,18(3):241-251.

[2]YANRB,YUANM,WUYF,etal.Rationaldesignandsynthesisofpotentaminoglycosideantibioticsagainstresistantbacterialstrains[J].BioorganiMedChem,2011(19):30-40.

[3]ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute.M100-S27Performancestandardsforantimicrobialsusceotibilitytesting,27thinformationalsupplement,2017.

[4]GalimandM,GerbaubG,CourvalinP.SpectinomycinresistanceinNeisseriasppduetomutationsin16SrRNA[J].AntimicrobAgentsChemother,2000,44(5):1365-1366.

[5]王梓,孔令聪,贾博岩,等.氨基糖苷类抗生素耐药机制研究进展[J].中国兽药杂志,2015,49（3）:65-69.

[6]Jun-ichiWachinoa,YoshichikaArakawa.Exogenouslyacguired16SrRNAmethyltransferasesfoundinaminoglycoside-resistantpathogenicGram-negativebacteria:Anupdate[J].DrugResistanceUpdates,

2012,15:133-148.