PCR荧光检测未来发展情况探讨

PCR荧光检测未来发展情况探讨

黄进林涛

黄进林涛

桂林市人民医院设备科541002

关键词：PCR，PCR荧光检测，PCR荧光检测仪单通道积木式设计，PCR试剂全程质控的网点式供货

PCR就是“聚合酶链式反应”（PolymeraseChainReaction），是一种在体外模拟天然DNA复制的过程。由于该项技术发明使得人类对生物学的认实取得重大进展。它在医学上的应用，对疾病的诊断有重大意义。

在医学诊断上，使用的是荧光定量PCR。其原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知的起始模板进行定量分析的方法。其技术优势有几个方面，光谱分析，灵敏度更高；探针使用，特异性更强；早期检测，缩短窗口期；实现对免疫力低下和免疫耐受个体的检测；高度自动化，操作简单，快速，便于数据的保存和统计分析。随着这方面的技术不断提高，这种诊断方法会不断向基层医院普及，做荧光PCR检测的数量和种类在不断增加。

这项技术的关键问题有两个。一个是PCR荧光检测仪，包括实时荧光定量PCR仪和荧光定性PCR仪两类。另一个就是检测相关病毒DNA的PCR试剂。下面就这两方面的问题，探讨一下未来的发展情况。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。如果在PCR反应体系中加入荧光基团，在一定量的紫外光激发下，目的基因的荧光发光强度会随时间成一定规律变化。PCR荧光检测仪就是跟据这个原理设计的。它包括温控系统和光学系统以及数据分析系统三部份。如果只有一个实验杯放入口，一路光学通道，就是一台单通道PCR荧光检测仪。由于PCR反应时间较长，大约要2小时，要想增加检测量就要采用多通道PCR荧光检测仪。

目前市场上出售的多通道PCR荧光检测仪是做在一个盒子里的，这样的设计至少存在两个问题。其一，如果某一部件损坏，则整台机器都不能用。其二，要想根据医院发展情况增加通道，则必须再买一台整机。未来的PCR荧光检测仪应当采用单通道积木式设计。一台单通道PCR荧光检测仪做成一个独立单元,它有实验杯放入口，通迅串口，电源口。任意两台的通迅串口，电源口可以对接。对接之后就成为一个双通道实体。如此延伸，按医院发展随意该变。最后通迅串口通过电缆与电脑连接，各通道的控制，检测数据的处理以及检测报告生成由电脑完成。这种单通道积木式设计，能够完全解决老式PCR荧光检测仪的以上两个缺点。

PCR试剂的制做技术含量较高，因而成本也较高。PCR试剂的使用有突发性，专用性和弥散性等特点。突发性是指PCR某种试剂的需求会因某种突发事件而成几十倍的增加。例如手足口病毒PCR试剂，会因为手足口病暴发而大量需求。专用性是指PCR的一种试剂只针对一种病毒。要检测不同DNA，就要用不同的试剂。弥散性是指PCR各种试剂的需求量，是因病人个体要求而定的。可能你订的试剂只用了几支，其余都放在那闲着。也可能病人有需要，由于你这里没有试剂而无法做。由前面介绍的PCR技术基本原理我们知道PCR试剂的储运对环境温度有很高要求。储运温度太低会失活，太高会发生变质。合理的温度是5-8摄氏度。根据量子化学原理，即使在规定储存温度范围内，也会随时间延长而发生变质，也就是说试剂有保质期。而且保质期会随储运温度升高而减少。依据上述分析我们可以看出，未来PCR试剂的销售模式应当是在各大中城市设供货网点，各网点对所服务的医院以另售方式供应试剂。这样工厂出来的试剂可以用专用周转箱发到供货网点，供货网点有专用冰柜保存，用保温箱向所服务的医院配送。这样才能做到PCR试剂全程质控，降低PCR荧光检测假性发生率。这种方式供货还可以解决由于试剂使用的突发性，专用性和弥散性所造成的医院浪费或缺货问题，为更好地推广PCR荧光检测技术铺平道路。

目前也有分散收集样本，集中做检测，全威机构发报告的模式。这种模式在目前检测仪器较贵的情况下有它的优势。但是也有样本从采集到检验时间过长，物流过程中会出意外等缺点。随着检测仪器生产技术提高，未来会被淘汰。

以上是我们对PCR荧光检测未来发展情况的看法，相信PCR荧光检测仪单通道积木式设计思想以及PCR试剂全程质控的网点式供货方式不久会被采纳。

（桂林市人民医院设备科黄进，林涛合著）

注：

dNTP：deoxy-ribonucleosidetriphosphate（脱氧核糖核苷三磷酸）的缩写。（http://baike.baidu.com/view/1984756.htm）PCR技术的基本原理（http://zhidao.baidu.com/question/8005801）