溶菌酶的纯化及发展

溶菌酶的纯化及发展

肖莹

肖莹（贵州大学生命科学学院制药工程专业06级一班，贵州贵阳550025）

中图分类号：O641TQ028.8Q55文献标识码：A文章编号：1673-0992（2009）12-030-01

关键词：溶菌酶性质；分离纯化；前景

溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。

一、分离纯化方法

1.结晶法

结晶法是一种传统的制备溶菌酶的方法，通过改变溶液条件，使溶菌酶以结晶态析出。以王敏的制备卵清溶菌酶实验方法为例，介绍结晶法制备溶菌酶：

结晶法分离溶菌酶的产率一般为60％～80％。

这种方法操作简单，应用于卵清溶菌酶结晶品的工业生产，使产品的成本大大降低，为其医药应用作出了贡献。但是其生产周期较长，产率相对偏低，高纯度产品获取过程复杂；另外此法不能用以分离微量的溶菌酶。

2.离子交换法

离子交换法一直以来都是溶菌酶生产所常用的方法，它是利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作技术，具有简便、高效、成本低，且可自动化连续操作的优点，陕西科技大学的宋宏新等人采用弱酸性阳离子交换树脂(724树脂)动态交换洗脱纯化工艺对鸡蛋壳中的溶菌酶进行分离，具体工艺如下：

分离过程中采取动态交换方法，即树脂装柱后抽提液缓慢流入柱中，用缓冲液洗涤，再用硫酸铵溶液洗脱。结果表明724树脂的吸附率达到83．5％。

3.色谱技术

色谱分离技术有多种类型，其中膜色谱技术是将液相色谱与膜分离结合起来的一种新技术，具有快速、高效、高选择性、易于放大的特点，能满足生物大分子高效分离与纯化的要求，它作为一种高效的分离纯化技术已受到人们的高度重视，广泛地应用于大分子物质的纯化。柯从玉研制出一种简易型色谱柱并通过装填大颗粒的疏水色谱填料对色谱柱的性能进行了考察，该柱的外形和操作如同传统的液相色谱柱，但它却在生物大分子分离方面有着和高效液相色谱相似的分辨率。另外，只要给该柱装填合适的固定相，比如疏水相互作用色谱固定相，便可用于蛋白质的复性及同时纯化。

高速逆流色谱技术是一种无固体载体的连续液一液分配色谱技术，其固定相通过重力场和离心力作用被保留在分离柱内，避免了固体载体与样品发生化学反应而不可逆吸附，样品回收率高，郅文波等人利用多分离柱高速逆流色谱，研究聚乙二醇1000(PEG1O00)一磷酸盐双水相体系的固定相保留率及该体系对蛋白质混合物进行分离，以14％PEGIO00—16％的磷酸盐体系的上相为固定相，在流速0．6tool／rain和转速900r／rain的条件下，根据细胞色素c、溶菌酶、和血红蛋白三者的分配系数的不同对其进行分离，三者的收率均大于90％。其色谱洗脱曲线见图

毛细管等电聚焦和电渗泵驱动聚焦色谱分离也引起了研究界的普遍重视，舒馨等人建立了一种利用电渗泵驱动毛细管内的聚焦区带，实现毛细管电泳等电聚焦分离蛋白质的方法。该方法在考察对牛血清白蛋白和溶菌酶两种粗提蛋白质混合物的分离，迁移时间的RSD分别为1.6％和1.3％，峰面积的RSD均为1.6％。

4.膜处理技术

膜处理技术主要是在一定的驱动力下，使溶液通过一定孔径的膜，以达到分离的目的。运用膜处理技术可以很好地通过调节而获得高产量和高纯度的产品，如果在无菌条件下操作，可以直接生产无菌的溶菌酶溶液，直接用于临床治疗。如今，人们在传统的膜处理的基础上，将固定离子亲和色谱与膜分离结合制备具有分离性能的固定金属亲和膜用于分离纯化蛋白质。

5.其他分离纯化技术

（1）反胶团萃取

反胶团是表面活性剂分子溶于非极性溶剂中自发形成的聚集体，其中表面活性剂的极性头朝内而非极性头朝外与有机溶液接触。胶团内可溶解少量水而形成微型水池，蛋白质、核酸、氨基酸等生物物质溶解在其中，由于胶团的屏蔽作用，这些生物物质不与有机溶液直接接触，起到保护生物物质活性的作用，从而实现生物物质的溶解和分离。该技术得到广泛关注，但由于该体系含有较高浓度的表面活性剂，界面张力低，易乳化在萃取过程中，水相离子强度一般较低，传质速度慢，分相困难。

（2）膨胀床吸附法

膨胀床吸附技术能直接从未经固液分离的生物产品料液中捕集目标产品，集固液分离、吸附纯化为一体，是一个过程集成的操作，可以直接从含有细胞或细胞碎片等固体颗粒的高粘度料液中分离纯化目标产物。

二、溶茵酶的开发前景

溶菌酶有广阔的应用前景。提取溶菌酶，是一项生产简单、投资少、见效快的开发项目，有巨大的经济价值。溶菌酶在医学和酶工程上的应用正方兴未艾。当前，溶菌酶的研究和应用尚处于起步阶段，还存在很多的问题。可以预见，溶菌酶将发挥越来越大的作用。

参考文献：

[1]王敏.蛋清提取溶菌酶技术

[2]宋宏新.鸡蛋壳溶菌酶分离纯化工艺研究

[3]王跃军，洪义国等.海洋低温溶菌酶的制备及酶学性质

[4]卫引茂.连续棒状弱阳离子交换柱的合成及其对蛋白质保留行为

[5]柯从玉.简易型变性蛋白复性并同时纯化色谱柱的研制及应用

[6]戴德舜，王义明，罗国安.高速逆流色谱研究进展

[7]郅文波，邓秋云高速逆流色谱双水相体系分离蛋白质

[8]舒馨，陈令新.毛细管等电聚焦和电渗泵驱动聚焦区带分离蛋白质

[9]赵雪雁.StreamlineSP膨胀床纯化溶菌酶

[10]陈慧英，吴晓英，林影.溶菌酶分离纯化方法的研究新进展