温阳振衰颗粒对慢性心衰模型兔TLR2/NF-κB细胞信号通路的影响

温阳振衰颗粒对慢性心衰模型兔TLR2/NF-κB细胞信号通路的影响

唐燕萍1林兴丽1张玮1陶佳豪1蒙泽振1

（1湖南中医药大学湖南长沙410007；2.湖南中医药大学第一附属医院湖南长沙410007）

摘要：目的观察温阳振衰颗粒对慢性心衰模型兔心肌TLR2及NF-κB蛋白表达的影响。方法68只家兔随机抽取11只为正常对照组，余57只注射阿霉素4周后随机分为模型对照组和各治疗组，各组用对应药物灌胃，连续4周。实验结束时分别检测各组家兔心肌TLR2、NF-κB蛋白的水平。结果与模型对照组比较，各治疗组心肌TLR2、NF-κB蛋白表达均降低（P＜0.05）。。结论温阳振衰颗粒可降低心衰模型兔心肌TLR2及NF-κB蛋白的表达，这可能是其治疗心衰时抑制细胞炎症反应的作用机制之一。

关键词：慢性心衰；温阳振衰颗粒；阿霉素；TLR2；NF-κB

EffectsofWenyangzhenshuaigranulesonTLR2/NF-κBcellsignalingpathwaysinarabbitmodelofchronicheartfailure

TangYanping1，LinXingli1，ZhangWei1，TaoJiahao1，MengZezhen1，HuShijun1，

CaiHuzhi2，LiuShang2，ChenXinyu2

（1.HunanUniversityofChineseMedicine，Changsha，Hunan410208，China，

2.TheFirstHospitalofHunanUniversityofChineseMedicine，Changsha，Hunan410007，China）

[Abstract]Objective：ToobservetheeffectsofWenyangZhenshuaigranulesontheexpressionofTLR2andNF-κBoftherabbitswithchronicheartfailure.Methods：The68rabbitswererandomlyselected11asnormalcontrolgroup.Theremaining57rabbitswererandomlypidedintomodelcontrolgroupandeachtreatmentgroupafter4weeksofinjectionofadriamycin，andeachtreatmentgroupwasgiventhecorrespondingdrugfor4weeks.Attheendoftheexperiment，thelevelsofTLR2andNF-κBweredetected.Results：Comparedwiththemodelcontrolgroup，theexpressionofTLR2andNF-κBproteinineachtreatmentgroupdecreased（P＜0.05）.Conclusions：WenyangZhenshuaigranulescanreducetheexpressionofTLR2andNF-κBproteinintheheartfailuremodelrabbit，whichmaybeoneofthemechanismsofinhibitingcellularinflammation.

[Keywords]Chronicheartfailure；WenyangZhenshuaigranule；Adriamycin；TLR2；NF-κB

慢性心力衰竭（Chronicheartfailure，CHF），是各种病因所致心脏疾病的终末阶段。CHF发病率高，有临床症状患者五年存活率与恶性肿瘤相仿。温阳振衰颗粒是湖南中医药大学第一附属医院的院内制剂，为临床治疗CHF的有效中药复方。本实验拟通过观察温阳振衰颗粒对CHF家兔心肌中TLR2、NF-κB蛋白表达的影响，探讨其防治CHF的机制。

1.材料

1.1动物

普通级新西兰兔，体重1.7-2.0kg，湖南中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（湘）2009-0012。

1.2药品及试剂

温阳振衰颗粒由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供；盐酸阿霉素由深圳万乐药业有限公司生产（批号H44024359，规格10mg/瓶）；依那普利片由山东辰欣药业股份有限公司生产（批号H20083605，规格10mg/片）。NF-κB抗体、TLR2抗体均由美国SantaCruz公司提供。

1.3主要仪器

超速离心机（美国BeckmanLE-80K公司）；电泳仪（北京六一仪器厂DYCZ-24F）；NovaBlot转印仪（美国GEhealthcare公司）。

2.实验方法

2.1造模、分组及给药

68只兔中随机抽11只为正常对照组，余57只按文献报道方法[1]复制CHF模型，将盐酸阿霉素用生理盐水稀释成1mg/ml的溶液，从耳缘静脉注射，每次1ml/kg，每周2次，连续8周。造模第4周末按心功能分层随机分为：模型对照组、温阳低、中、高剂量组和阳性对照组。在第5周开始温阳低、中、高剂组分别予温阳振衰颗粒0.4、0.8、1.6g/（kg?d）用蒸馏水稀释后灌胃，阳性对照组予依那普利5mg/（kg?d）配以蒸馏水灌胃（按照人兔体表面积换算[2]），正常对照组及模型对照组均灌服等量蒸馏水，每日1次，各组均连续灌胃4周。

2.2Westernblot法检测心肌中TLR2、NF-κB蛋白表达

兔子处死后取心肌组织，加组织裂解液，提取总蛋白，Bradford法测定蛋白质浓度；然后分装，-80℃保存备用。检测时分别加入抗TLR2、NF-κB（1：1000）抗体，4℃过夜。TBS-Tween20漂洗10min×3次，将膜取出，置于另一杂交袋中，加入酶标二抗（1：2000），室温杂交2h。TBST漂洗10min×3次，化学发光液曝光，显像，扫描（300dpi），以TLR2、NF-κB蛋白条带灰度值与内参GAPDH蛋白条带灰度值的比值表示TLR2、NF-κB蛋白的相对表达水平。

2.3统计学方法采用SPSS19.0统计软件进行分析，计量资料以表示，多样本均数间比较用单因素方差分析（One-wayANOVA）检验。

3.实验结果

3.1实验兔数量变化情况

68只家兔在造模过程中死亡2只，4周末分组后模型对照组、温阳中剂组和阳性对照组实验兔因腹泻各死亡1只。

3.2实验兔心肌中TLR2、NF-κB蛋白表达（见表1）

注：与正常对照组比较，aP＜0.01；与模型对照组比较，bP＜0.05；与温阳低剂量组比较，cP＞0.05；与温阳高剂量组比较，dP＜0.01，eP＞0.05，fP＜0.05。

4.讨论

研究证实，Toll样受体家族（Toll-Likereceptors，TLRs）及信号传导通路在心室重构中起重要作用[3]。TLR2是TLRs家族最重要的亚型。TLR2抑制后可通过调节炎症反应和凋亡通路，改善阿霉素引起的心功能不全[4]。在复制心衰模型时阿霉素可以明显诱导TLR2表达的上调，引起TLR2下游信号通路如NF-κB过度活化[3]。NF-κB是一种重要的核转录因子，被激活后还可以促进心肌重构；而且CHF时心脏可表达多种炎性细胞因子，利用NF-κB通路作为炎性细胞因子激活、产生和持续释放机制之一[4]。

温阳振衰颗粒主要由附子、红参、干姜、甘草等药物组成。附子能回阳救逆，助阳补火，散寒止痛，乃治疗阳衰阴盛、水湿肿满等病症之要药。红参大补元气，复脉固脱，补益脾肺，适于急救回阳，与附子合而为君；干姜味辛，性热，具有温中散寒，回阳通脉的作用，为臣药。甘草能益气补中，调和诸药，还可减轻附片毒性。诸药合用，共奏温阳益气、利水消肿之功[5]。该实验结果提示，温阳振衰颗粒能不同程度降低CHF兔NF-κB、TLR2的水平。这说明温阳振衰颗粒可能通过抑制TLR2、NF-κB蛋白的表达，从而抑制炎症反应，改善阿霉素引起的心功能不全。

参考文献

[1]张静，李庚山，李国草，等.兔阿霉素心衰模型的建立[J].心脏杂志，2004，16（5）：437-439.

[2]于厚志，杨庆.依那普利对实验兔肥厚心室肌电重构的影响及其机理研究[J].中华心血管病杂志，2005，6（33）：565-567.

[3]马永刚.阻断样受体活性改善阿霉素及缺血诱导的心功能障碍及心肌重塑[D].北京，北京协和医学院药物研究所，2010：50-52.

[4]张双伟，吕丽萍.毛冬青颗粒对慢性心力衰竭患者核因子κB和B型尿钠肽水平的影响[J].江西中医药，2013，44（355）：28-29.

[5]唐燕萍，蔡虎志，刘尚，等.温阳振衰颗粒对慢性充血性心力衰竭模型兔NT-proBNP、IL-1及IL-6的影响.湖南中医杂志，2014，30（11）：151-153.

基金项目：湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目（290）；中西医结合防治心脑疾病的相关基础研究湖南省高校科技创新团队项目（2015CXTD）；湖南中医药大学中医内科重大疾病防治研究及转化教育部重点实验室开放课题基金资助课题（ZYNK201509）

作者简介：唐燕萍，女，讲师，研究方向：中医药防治心血管疾病。

通讯作者：陈新宇（1962.1-），男，教授，博士研究生导师，主要从事中医药防治心脑血管疾病的研究。