全基因组测序技术应用于兰科植物

全基因组测序技术应用于兰科植物

黄慧霞

——探析国家兰科中心蝴蝶兰与铁皮石斛基因测序技术及应用

全国兰科植物种质资源保护中心暨深圳市兰科植物保护研究中心广东深圳518114

摘要：国家兰科中心率先同行开发出蝴蝶兰与铁皮石斛全基因组测序技术，该技术推动兰科植物基础研究和相关产业开发应用，对园艺、生物医药等行业发展具重大的意义和深远的影响。

关键词：基因测序；小兰屿蝴蝶兰；铁皮石斛；应用

一、对兰科植物进行全基因组测序的背景

兰科植物（俗称兰花）有近900属，28000多种，占全世界被子植物种类的8%-10%，是被子植物第二大科和单子叶植物最大的科，广泛分布于除两极和极端干旱沙漠地区以外的各种陆生系统中，是植物界最大和进化程度最高的家族之一，是生物多样性和进化研究的理想模式类群，具有极高的科研价值。兰科植物是世界性濒危物种，其所有种类均被列入《野生动植物濒危物种国际贸易公约》保护范围，占该公约应保护植物的90%以上。

兰科植物中小兰屿蝴蝶兰（Phalaenopsisequestris）的许多种类色彩艳丽、花期长，是世界花卉名品；铁皮石斛（Dendrobiumcatenatum）作为我国传统中药，被列入《全国集体林地林药林菌发展实施方案（2015-2020年）》，是生态林业经济新模式——林下经济的重要发展对象。中国兰文化传统赋予兰科植物更高的寓意，使得兰科植物广受欢迎，形成花卉生产的大产业，具有很高的观赏、商业价值。

究竟是哪些基因导致兰花演化出如此丰富的生物多样性，一直是悬而未决的问题。兰科植物基因组的研究是全面了解兰科物种和推动相关产业发展的基础工作，是对植物界遗传和进化等重大科学问题的研究，受到全世界研究者的重视和关注，对兰科遗传育种和品种创新以及产业技术转化具有重要指导作用。

近年来，随着高通量测序技术和生物信息学研究的高速发展，及其在基因组研究中的成功应用，越来越多的植物基因组被测序。高通量测序和生物信息学研究技术的发展为全面了解兰科植物的遗传基础提供了有力手段。

目前，拟南芥、水稻等多种被子植物均已完成了全基因组测序。由于兰科植物的基因组存在高杂合、高重复、长内含子等特点，因此严重阻碍了兰科植物的全基因组测序，致使其全基因组序列较少。为了更好地从遗传基础层面了解兰科植物，进而对兰科植物进行保护和利用，开发出适合兰科植物的全基因组测序技术并对兰科植物进行基因组测序是十分必要的。

为打破兰科植物基因组测序困难、遗传背景不清晰等困境，国家兰科中心（以下简称“兰科中心”）针对兰科植物自身特点开发出兰科植物基因组测序技术，在世界上率先创建了“蝴蝶兰与铁皮石斛全基因组测序技术”。通过选定经过形态和分子鉴定的小兰屿蝴蝶兰、铁皮石斛等兰科植物为研究对象，借助高通量测序平台，结合生物信息学、分子生物学、蛋白质组、生物化学等多学科交叉研究手段，开发出适合兰科植物的基因组测序技术，对蝴蝶兰、铁皮石斛等兰科植物进行基因组测序和个性化分析。同时，在高质量基因组图谱的基础上，深入探寻花形态构成、药用活性成分合成、景天酸代谢等相关功能基因及表达规律，为植物进化、兰花保护、遗传工程育种、药用成分开发利用等提供重要的理论依据和指导，提升我国在生物学、高效利用水分、生物多样性以及环境气候变迁等领域的原始创新能力和研究水平，并推动基因组测序、兰花花卉创新、药用成分开发等产业的发展。

二、具有创新性的关键技术内容

（1）率先开发出“蝴蝶兰与铁皮石斛全基因组测序技术”，对种源准确的小兰屿蝴蝶兰和铁皮石斛进行全基因组测序

完成小兰屿蝴蝶兰全基因组测序，首次成功绘制出小兰屿蝴蝶兰高质量全基因组图谱。这是世界上第一个完成测序和分析的兰科植物和景天酸代谢植物的基因组图谱。该成果被NatureGenetics作为封面文章发表，并被国际权威专家认为是揭开了困扰人类数百年的兰花之谜。该成果同时被评为2014年中国野生动植物保护十大事件之一。

在世界上首次完成达到精细图谱的铁皮石斛全基因组测序，成果被Nature子刊ScientificReports作为封面文章发表，不仅解决了兰科植物进化的重大科学问题，还为铁皮石斛遗传工程育种和药用成份的开发利用，规范产业发展研究提供重要资源和基础。

（2）首次鉴定铁皮石斛药用成分多糖合成途径的功能基因，探寻多糖合成的分子机制

铁皮石斛是具有2000多年药用历史的名贵中药，被誉为中华“九大仙草”之首。现代药理学研究发现，铁皮石斛的多糖、生物碱、氨基酸等成分具有抗肿瘤、抗衰老、提高免疫功能、提高记忆力以及治疗老年痴呆症等作用。其中，石斛多糖是其重要药用成份，兰科中心首次发现铁皮石斛的药用多糖合成相关的基因大量扩增，揭示了铁皮石斛产生大量的石斛多糖和茎干变得肥大的分子机制，从而了解铁皮石斛产生药用多糖的基因调控机理。研究还发现铁皮石斛多糖代谢的通路和该通路中多糖合成环节中的关键基因，为研究合成药用多糖提供分子基础。成果在ScientificReports作为封面文章发表。

（3）首次分析植物景天酸代谢（CAM代谢）功能基因、兰花花发育调控基因（MADS-box基因家族），为遗传工程育种、花卉品种创新以及农作物抗旱相关研究奠定基础

小兰屿蝴蝶兰属于景天酸代谢附生植物，该代谢途径大大提高了植物对水的利用率。通过对景天酸代谢途径的六个关键基因家族的分析，发现其中四个基因家族在蝴蝶兰中发生了特异的基因重复和丢失，这将对兰花中景天酸代谢途径的演化具有重要贡献。该成果在NatureGenetics作为封面文章发表。

兰花尤其以它特殊的花形态著称，而MADS-box基因家族是调控植物发育尤其是花发育的重要基因。兰科中心首次分析了蝴蝶兰和铁皮石斛中的MADS-box基因家族的分布和演化，从蝴蝶兰和铁皮石斛中分别鉴定出60和75个MADS-box基因。发现了多个在兰花中特异扩增和分化的MADS-box基因，这些特有的基因对高度特化的兰花形态发育发挥重要作用。其中发现铁皮石斛MADS-boxI类基因家族成员发生了丢失，是致使铁皮石斛具有许多种子而种子没有胚乳的主要原因。

（4）基于基因组数据，首次为自交不亲和机制的研究提供基因组水平的证据

植物的自交不亲和现象是植物进化的动力之一，植物中有60%的物种存在自交不亲和现象，自交不亲和能产生健康后代，促进物种分化和繁殖。兰科中自交不亲和机制的研究一直未有报道，兰科中心在小兰屿蝴蝶兰的基因组中发现了一段高杂合区存在的基因与自交不亲和密切相关，这为兰科乃至整个植物界中自交不亲和机制的研究提供了基因组水平的证据。

（5）研究铁皮石斛广泛的生态适应性的基因调控机制，解决了铁皮石斛地理分布特性的成因，为铁皮石斛栽培提供指导

通过基因组数据的比较发现，铁皮石斛基因组中有数量更多的抗性基因和热敏蛋白基因。抗性基因在植物受到病菌侵袭时发挥重要作用，热敏蛋白基因在植物受到热击以及对其他生物和非生物因素的应答中发挥重要作用。铁皮石斛可以在潮湿以及干旱的环境中生长，耐受低温和高温，因此可以推测铁皮石斛中抗性基因和热敏蛋白基因的大量扩增与其在更广泛生境中适应性的形成相关。

（6）率先建立兰科植物组学数据库OrchidBase，为兰科植物研究搭建基础科研和应用平台

兰科中心首次建立了兰科植物全基因组水平的数据库OrchidBase，数据库涵盖了多个兰科植物的全基因组数据，以及兰科植物二十余个不同物种、植物组织的转录组数据，横跨兰科植物五大亚科。数据库所提供的原始资料能够极大推动兰科植物的基础科研，并辅助分子育种。

（7）首次从全基因组水平厘清铁皮石斛的种源问题，解决目前铁皮石斛种源混杂、伪劣产品充斥市场的问题

制定了全球首个关联全基因组序列的药用植物标准——《石斛种质鉴定技术规范》，将铁皮石斛基因组数据首次应用于石斛种质鉴定技术，规范了种源不清等问题。

（8）建立友好型栽培生产模式

兰科中心利用测序的分子数据开展了开发利用研究，建立了“保护-开发-利用”的友好型栽培生产模式，保证产品品质又兼顾物种及环境保护，促进了产业化发展。

三、全基因组测序技术的应用范围及意义

针对兰科植物特点开发出“蝴蝶兰与铁皮石斛全基因组测序技术”，并在高质量基因组图谱的基础上，深入分析花形态构成、药用活性成分合成、景天酸代谢等相关功能基因及表达规律，探寻研究成果在科学研究、实际生产、技术服务等多领域的应用方案。基因测序创新成果在生物信息分析、蝴蝶兰和石斛的分子育种、花卉、药材及制品等多个领域以及石斛产业得到成功应用与推广，为各测序公司提供了蓝本，为药用成份的开发利用、花卉品种创新以及规范产业发展等提供重要资源和基础，经济和社会效益显著。

该技术解决了兰科植物基因组测序的难题，填补兰科植物组学数据库的空白，建立兼顾物种保护和开发利用的栽培模式，规范种源混杂、以次充好的石斛产业，为兰科植物组学研究提供数据和技术支撑，培养了一支基因组学、植物学以及分子生物学的专业技术人才队伍，推动兰科植物基因组测序行业和药用成分利用、花卉创新等相关产业的发展。