冬凌草甲素对H2O2所致HUVEC损伤的抗凋亡作用研究

冬凌草甲素对H2O2所致HUVEC损伤的抗凋亡作用研究

赵燕娜1许健1邓同乐2沃兴德1

赵燕娜1许健1邓同乐2沃兴德1

（1浙江中医药大学生命科学学院浙江杭州310053；2浙江大学生物医学工程系杭州310027）

【摘要】目的：通过建立过氧化氢损伤模型，研究冬凌草甲素对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)氧化损伤的抗凋亡作用。方法：MTT法选择冬凌草甲素药物作用浓度，激光共聚焦显微术进行形态学观察，流式细胞术检测细胞凋亡。结果：流式细胞技术检测的结果显示经过2μM的H2O2诱导后的HUVEC，其坏死率达到33.64±1.33%，凋亡率达到20.62±2.11%；经过oridonin预保护的HUVEC坏死率和凋亡率明显得到改善，其中4μg/mloridonin作用尤为显著，达到坏死率4.87±2.52%和凋亡率5.1±3.09%；激光共聚焦显微术观察可见，冬凌草甲素明显抑制模型组的凋亡。结论：冬凌草甲素具有抑制H2O2诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的作用。

【关键词】冬凌草甲素；人脐静脉内皮细胞；细胞凋亡

【中图分类号】R285.5【文献标识码】B【文章编号】1672-2523（2011）05-0076-02

冬凌草甲素(oridonin)是从唇形科(Labtea)香茶菜属(Rabdosia)植物中分离出的一种贝壳杉烯二萜类(Ent—kaurenediterpenoid)天然有机化合物，味甘苦、性微寒，具有清热解表、消炎止痛、健胃活血等作用[1]。

研究表明，较高浓度的冬凌草甲素有抗肿瘤作用[2]，而低浓度的冬凌草甲素是抗氧化作用的[3]。本实验建立过氧化氢损伤模型，采用低浓度的冬凌草甲素孵育人脐静脉内皮细胞，观察其抗氧化作用机制。

1实验仪器与材料

激光共聚焦显微镜LSM510（CarlZeiss，德国）流式细胞仪（BDFACSCalibur）；胎牛血清（fetalbovineserum，FBS，杭州四季青生物材料工程研究所）；oridonin（上海同田生物技术有限公司）；二甲基亚砜（DMSO，国药集团化学试剂有限公司）；过氧化氢(H2O2，上海哈勃化学技术有限公司)；噻唑蓝(MTT，Sigma）；凋亡检测试剂（FITC-conjugatedannexinVapoptosisdetectionkit联科公司）；M200（Gibco）；低血清添加物（LSGS，Gibco）；健康新生儿脐带（取自浙江省妇幼保健医院）

2实验方法

图1原代人脐静脉内皮细胞普通显微镜拍照bar=20um

2.1原代人气静脉内皮细胞的分离与培养选取无夹痕，无创伤淤血的10~15cm脐带，PBS洗至外表面无血丝滞留，两端用插管套紧，注射器冲洗至洗出液无色透明。止血钳夹紧一端插管，从另一端吸走空气后注入0.25%的胰蛋白酶，37℃消化20min；收集消化液，M199培养液冲洗脐静脉，将所得收集液2000rpm/min离心10min。弃上清液，加入培养基M200和低血清添加物LSGS的混合培养液吹打混匀成细胞悬液，调整细胞浓度为5×104/ml，37℃5%CO2培养箱中静置培养。

2.2oridonin加药浓度的选择调整对数生长期细胞浓度为0.5-1×104个细胞，接种于96孔板中，每孔200μL，对照组仅加入培养基，oridonin分为（0、2、4、8、16）μg/mL5组，每组设3个复孔，实验重复3次，培养12h后，加入10μLMTT，继续培养4h离心弃上清，每孔加入200μL的DMSO，振荡10min，用全自动酶标仪在490nm波长处读取吸光值。

2.3流式细胞技术联合AnnexinV-FITCIPI双标记法检测细胞凋亡将HUVEC培养至第3代，种于24孔板中，无血清培养8h。分为5组：空白对照组、H2O2模型组、H2O2+2μg/mLoridonin组、H2O2+4μg/mLoridonin、H2O2+8μg/mLoridonin37℃，CO2培养箱中培养12h后。胰酶消化，M199+10%胎牛血清终止消化。1000rpm/min离心5min，倾去上清液，加入500μl的1×bindingbuffer，5μL的AnenexinV和10μL的PI，避光室温孵育20min后，再加入200μL的PBS，上机检测；测定细胞数为10000个；使用流式细胞仪的BDFACSCalibur系统。流式细胞仪光源为488nm氩离子激光器，FITC受激发后发绿色荧光，PI发红色荧光。

2.4激光共聚焦显微术联合AnnexinV-FITCIPI双标记法检测细胞凋亡将HUVEC培养至第3代，接种于打孔皿中。加入无血清培养基培养8h，分为3组：对照组、H2O2模型组、H2O2+4μg/mLoridonin组。置于37℃CO2培养箱中培养12h。加入500μl的1×bindingbuffer，5μLAnenexinV和10μL的PI，避光室温孵育20min，激光共聚焦显微镜(CarlZeiss)进行图像采集。

2.5统计学处理实验数据以±S表示。采用SPSS12.0软件包分析对实验数据进行One-wayANOVA分析及LSD两两比较。

3实验结果

3.1细胞形态学观察图1可见，正常生长的HUVEC接种后4h内，细胞基本贴壁伸展，呈单层扁平状生长；12h后HUVEC细胞生长旺盛，梭形细胞呈典型铺路石样排列。

3.2oridonin加药浓度的选择

图2oridonin加药浓度的选择

由上图可见，与对照组相比H2O2模型组和oridonin的加药浓度在大于8μg/mL、16μg/mL和小于2μg/mL时，细胞存活率均显著降低（P<0.01），有显著性差异。而oridonin的加药浓度在2μg/mL、4μg/mL时，与对照组相比无显著性差异。

3.3流式细胞技术检测细胞凋亡

图3AnnexinV-FITC/PI双标法观察oridonin对细胞凋亡的影响。A：门控；B：正常对照组细胞；C：H2O2孵育后的HUVEC模型组；D：H2O2+2μg/mloridonin组。E：H2O2+4μg/mLoridonin组。F：H2O2+8μg/mLoridonin组。

由图3可见，H2O2孵育组与对照组比较，细胞凋亡率和坏死率显著增加(P＜0.05)；经过oridonin孵育的细胞坏死率和凋亡率明显得到改善，其中4μg/mloridonin作用尤为显著，达到坏死率4.87±2.52%和凋亡率5.1±3.09%，抗氧化作用达到高峰见图3E；当到达8μg/mloridonin时，细胞坏死率逐渐升高，说明oridonin在浓度达到8μg/ml时，产生细胞毒性见图F，结果提示oridonin能够抑制H2O2对内皮细胞产生的氧化损伤作用，呈剂量依赖性，且最佳浓度为4μg/ml。

4激光共聚焦显微术观察细胞凋亡

AnnexinV-FITC/PI双染再次证明同样结果，AnnexinV阳性染色（绿色）为凋亡细胞，PI阳性染色（红色）为坏死细胞。正常细胞双色分布都很少。而在使用H2O2破坏细胞后，AnnexinV-FITC/PI双染阳性率增多，细胞膜破裂，可见到凋亡小体，表明有大量细胞凋亡。经oridonin预保护细胞后，AnnexinV-FITC/PI双染阳性率减少，表明oridonin可阻断细胞凋亡通路，减少细胞凋亡保护内皮细胞。

Figure14：激光共聚焦显微术检测细胞凋亡。A：controlB：H2O2C：H2O2+4ug/mloridonin

4讨论

血管内皮细胞(vascularendothelialcell，VEC)是介于血液与血管壁之间的屏障，它能促进血液循环、有效的调节血管的收缩舒张作用、抑制细胞外基质沉积以及防止平滑肌细胞增殖[4]。内皮细胞损伤后，会引起内皮的功能障碍，成为高血压、动脉粥样硬化、心力衰竭等心血管疾病的发生、发展的一个重要诱因。引起内皮损伤的因素很多，如细胞因子、活性氧、脂肪酶(LPS)等，其中氧化应激引起的内皮细胞氧化损伤是引起血管内皮功能障碍的一个重要方面。

冬凌草甲素常见的药理作用主要有抗氧化作用[5]、抗肿瘤作用[6]、抗突变作用[7]。本实验表明H202可导致血管内皮细胞凋亡，而冬凌草甲素可以降低受损伤细胞的凋亡率和坏死率，说明冬凌草甲素具有抗HUVEC细胞凋亡的作用。AnnexinV-FITC/PI双染再次证明同样结果，H2O2破坏细胞后，AnnexinV-FITC/PI双染阳性率增多，细胞膜破裂，可见到凋亡小体，表明有大量细胞凋亡。而经oridonin预保护细胞后，AnnexinV-FITC/PI双染阳性率减少，表明oridonin可阻断细胞凋亡通路，减少细胞凋亡保护内皮细胞。

综上所述，冬凌草甲素除了目前比较热门的抗肿瘤作用，还具有抗氧化作用，其作用机制还有待继续深入探讨。

参考文献

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[2]W.T.Fang,H.J.LiandL.S.Zhou.ProtectiveeffectsofprostaglandinE1onhumanumbilicalveinendothelialcellinjuryinducedbyhydrogenperoxide[J].ActaPharmacolSin,2010,31(4):485-492.

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[4]SchmideHH,WalterU.NOatwork[J].Cell.1994,78(6):919-925

[5]张予,王筠,楼丽广,等.冬凌草甲素对活性氧自由基的清除作用[J],河南医学研究,1999,8(2):100-104.

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[7]杨胜利,张巧,等冬凌草甲素抗突变性研究，癌变.畸变.突变[J].2001,13(1):8-10.