GC-MS单点外标法检测生物检材中的苯巴比妥

GC-MS单点外标法检测生物检材中的苯巴比妥

瞿勇强解润芳李桢李慧方洁王蕊

瞿勇强解润芳李桢李慧方洁王蕊

（昆明医科大学法医学院云南昆明650500）

基金项目：云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项资金项目，项目编号（2014FB013）

通讯作者：解润芳（1974—），女，讲师，硕士，研究方向：毒药物分析

[摘要]目的建立一种简便、快速、准确、可靠的单点外标法检测生物检材中的苯巴比妥。方法丙酮：水(v/v8:2)对生物检材进行浸泡，然后在pH=3~4的条件下，用乙酸乙酯进行提取分离，GC-MS对样品进行检测，用总离子流图（TIC图）中苯巴比妥保留时间及质谱图中苯巴比妥的特征离子碎片定性，以单点外标法进行定量。结果该方法简单易操作，背景干扰小，分离效果好，分析速度快。结论该方法可用于法医毒物分析生物检材中苯巴比妥的检验，结果令人满意。

[关键词]法医毒物分析，单点外标法，GC-MS，生物检材

本文基于苯巴比妥的理化性质及参考文献[4-8]的基础上，提出采用GC-MS单点外标法检测生物检材中的苯巴比妥，生物检材经过简单的样品前处理，用GC-MS对样品进行定性定量分析。

1材料与方法

1.1主要仪器和试剂

GC/MS：Agilent7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪；配有电子轰击离子源(EI)及Nest11.0化学图谱库

苯巴比妥标准溶液（1.0mg/mL，购自司法部司法鉴定科学技术研究所）

甲醇（色谱纯）

二次蒸馏水

1.2溶液配制

苯巴比妥标准工作溶液：准确移取一定量上述苯巴比妥标准溶液置于10mL容量瓶中，用色谱纯甲醇稀释至刻度，使其浓度为0.01mg/mL。

待测样品：沙先生心血，沙先生肝脏，沙先生胃及胃内容物

1.3实验方法

1.3.1GC/MS仪器条件

离子源：EI源，离子化能量：70eV，离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；色谱柱：HP-5ms30m×0.25mm×0.25μm。进样口温度：280℃；传输线温度：250℃；程序升温：初温80℃保持3min，以30℃/min的速率升温到300℃，保持8min；进样方式：分流进样，分流比：10:1；载气：氦气，纯度：＞99.99%，流速：1.0ml/min。

1.3.2样品前处理

分别取送检沙先生心血5mL，沙先生肝脏10g（剪碎），沙先生胃及胃内容物10g（剪碎），置于50mL具塞塑料离心管中，均加入20mL丙酮：水(v/v8:2)浸泡约30min，然后置于3000r/min离心机离心3min，取出上清液分别放置于三个瓷坩埚中，残渣仍然用20mL丙酮：水浸提二次，并把后二次的上清液合并于同一个瓷坩埚中，把瓷坩埚放在85℃水浴锅上挥干，取下瓷坩埚，冷却至室温。

再用15mLpH=3~4的盐酸水溶液少量多次的洗涤瓷坩埚上的挥干物，并转移至50mL具塞塑料离心管，用50mL乙酸乙酯萃取三次，三次萃取液都置于同一瓷坩埚中，把瓷坩埚放在85℃水浴锅上挥干，取下瓷坩埚，冷却至室温，用色谱纯甲醇少量多次地洗涤瓷坩埚中的物质，并定容在1mL色谱纯甲醇中，置于进样瓶中，分别得到沙先生待测心血，沙先生待测肝脏，沙先生待测胃及胃内容物。

1.3.3分析检测

将空白对照样品（色谱纯甲醇），0.01mg/mL苯巴比妥标准工作液，沙先生待测心血，沙先生待测肝脏，沙先生待测胃及胃内容物，分别进样1μL，用GC/MS在1.3.1条件进行分离分析。

2结果与讨论

2.1对照样品结果及讨论

空白对照样品在TIC中8.385min处未出峰，说明色谱纯甲醇可以作为空白试剂使用，不影响测定，可排除假阳性干扰的可能。在苯巴比妥标准工作液的TIC中，8.385min出现苯巴比妥的色谱峰，而且峰形很好基本成正态分布，说明所建立的分离分析方法适用于苯巴比妥的检测。为苯巴比妥TIC中色谱峰所对应的质谱，MS中显示了苯巴比妥的特征离子碎片为：204及232，与Nest11.0化学谱库中苯巴比妥的匹配度很高＞95%，进一步确证为苯巴比妥，而且GC/MS分离分析方法还给出了苯巴比妥的分子结构，使定性更加准确、可靠。

2.2待测样品结果及讨论

沙先生待测心血的TIC，在TIC中8.385min未出现苯巴比妥的色谱峰，可以得出沙先生待测心血中未检出苯巴比妥的结论。分别为沙先生待测肝脏及沙先生待测胃及胃内容物的TIC及所对应的MS,沙先生待测肝脏在8.472min处出现苯巴比妥的色谱峰，沙先生待测胃及胃内容物在8.462min处出现苯巴比妥的色谱峰，与苯巴比妥标准工作液中苯巴比妥的保留时间8.385min比较二者均存在微小的差别，其中，相对误差最大的为1.03%，在定性过程中误差小于3%，不影响定性的准确性；在MS图中沙先生待测肝脏及沙先生待测胃及胃内容物也都显示了苯巴比妥的特征离子碎片为：204及232，与Nest11.0化学图谱库中苯巴比妥的匹配度很高＞95%，这都将成为沙先生待测肝脏及沙先生待测胃及胃内容物中检出苯巴比妥的直接依据。

2.3定量结果及讨论

2.3.1定量待测肝脏的制备

准确称取沙先生肝脏10.30450g（剪碎），按1.3.2的方法进行样品前处理后，得到沙先生定量待测肝脏（CX）；将沙先生定量待测肝脏用GC/MS在1.3.1条件下进样1μL，得到以204的特征离子碎片为定量离子的峰面积（AX）。

将0.01mg/mL苯巴比妥标准工作液（CS），用GC/MS在1.3.1条件下进样1μL，得到以204的特征离子碎片为定量离子的峰面积（AS）。

2.3.2肝脏中苯巴比妥的量及讨论

按以下两式计算沙先生肝脏中苯巴比妥的含量（WX）：

式中—V表示定容体积（mL）；W表示称取检材的量（g）

由上述公式计算得沙先生肝脏中苯巴比妥的含量为0.0067mg/g，未超出临床用药的剂量，可得出沙先生不是死于苯巴比妥中毒的结论。

2.4方法回收率

用移液器精确吸取空白全血0.99mL四份，分别在四份空白全血中加入0.01mL浓度为1mg/mL苯巴比妥标准溶液，使空白全血中苯巴比妥的添加浓度均为0.01mg/mL。再按1.3.2的方法对四份空添样品进行处理后，分别进样1μL，用GC/MS在1.3.1条件进行分离分析，以204的特征离子碎片作为定量离子碎片，可得到四份空添样品的峰面积。由2.3.2中①式可以计算得到四份空添样品的实际测得浓度，从而得到四份空添样品的平均测得浓度，因此，四份空添样品的平均测得浓度除以添加浓度0.01mg/mL，再乘以100%可计算得出回收率；所建方法的回收率为87.35%。

2.5方法精密度

把0.01mg/mL苯巴比妥标准工作液，用GC/MS在1.3.1条件下，连续进样5次，每次进样1μL，可得到5次进样204的特征离子碎片的峰面积，由此可计算方法的精密度，所建方法的相对标准偏差RSD为5.43%，RSD小于10%。

2.6方法稳定性

考察方法的稳定性，把按2.4方法配制的空白血添加样品，分别在样品处理前、后室温放置1、3、6、12、24h后，经过1.3.2的方法进行样品处理后，用GC/MS在1.3.1色谱条件下进样进行测定，分析结果相对误差均小于10%。

2.7最低检测限[Thelowestlimitofdetection(LLOD)]

分别准确把0.01mg/mL苯巴比妥标准工作液液，用色谱纯甲醇梯度稀释配制成苯巴比妥含量为0.005mg/mL、0.001mg/mL的标准工作液。用GC/MS在1.3.1色谱条件下进样进行测定。检测结果显示，苯巴比妥含量为0.005mg/mL的标准工作液S/N>3，苯巴比妥含量为0.001mg/mL的标准工作液S/N<3。

3结论

采用气相色谱-质谱联用法（GC-MS）测定生物检材中的苯巴比妥是一种简便、快速、准确、可靠的方法，具有许多优点。方法简单、易操作、生物样品仅仅经过简单的样品前处理，但检测结果显示基质干扰小，分离效果好，特别适用于临床及司法鉴定中快速测定的要求。所建方法以总离子流图苯巴比妥的保留时间初步定性，并将质谱图与Nest11.0化学图谱库比较进行确证，用单点外标法进行定量分析，方法定性定量准确。

参考文献

[1]张杰.浅谈红外光谱法定性分析苯巴比妥的一点体会.[J].中国医药指南.2013.11(36):374-375

[2]王勇,黄竹芳,贠克明,尉志文,王哲焱.生物检材中苯巴比妥气相色谱和气相色/质谱检测.[J].中西医结合心脑血管病杂志.2009.7(5):567-568

[3]刘光斌,姜芳宁,高颖.高效液相色谱外标法快速测定苯巴比妥血药浓度.[J].中国医院用药评价与分析.2012,12(9),811-813