深部真菌病的检验诊断

深部真菌病的检验诊断

姜雯

姜雯（黑龙江省国家农业标准化监测与研究中心150036）

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）13-0230-02

【关键词】深部真菌病检验诊断

近几十年来，随着科技的发展，时代的进步，免疫受损人群急剧扩大，导致各种深部真菌病尤其是机会真菌感染的发病率迅速上升。由于这类病多继发于严重的基础病和艾滋病、恶性肿瘤、糖尿病、烧伤、器官移植等，使得早期症状常不特异，一旦确诊其病情已十分凶险，故死亡率较高。据国内外资料显示，深部真菌病的早期诊断水平已成为临床医学的重要课题。

深部真菌病的病原茵主要有两大类，即酵母和霉菌(除皮肤癣菌外的丝样真菌)，前者以念珠菌和隐球菌为最常见，后者以曲霉为主要分离菌。

(一)病原性酵母菌的鉴定

微生物学家及临床医生应清楚任何属或种的酵母都有可能是免疫受损患者潜在的致病源。因此专家们建议：①所有分离自无菌体液，包括脑积液、血液、尿液、穿刺液及其他体液的酵母菌应鉴定至种的水平；②分离自所有严重疾患或免疫受损患者或怀疑是真菌感染的患者的酵母菌应鉴定至种的水平；③来自呼吸道分泌物的酵母菌一般不做鉴定，但应排除新型隐球菌的存在；④从任何临床标本中分离出的大量酵母菌应鉴定至种的水平；⑤来自若干连续取材的标本的酵母菌，除呼吸道分泌物，也应鉴定至种的水平。

所有临床分离的酵母均应先做芽管试验，阳性说明是白念珠菌，不必再做其他试验，这是一个十分有效且经济的筛选性试验，因为酵母菌临床分离株的75％为白念珠菌。

API-20C酵母系统：为目前所用的已商品化的系统中应用最广泛的酵母鉴定系统，条纹中含有20个微小杯形池，其中19个含有脱水的底物，第一个为全空白对照，判读反应后结果转为7位数的生物型数码，然后与编码本进行对照，做出鉴定。大多数酵母48小时内可鉴定，新型隐球菌和毛孢子菌则需72小时。API-20C像其他商品化的产品一样，需辅以在含1％Tween-80和台酚蓝的玉米粉琼脂上生长的酵母的显微镜形态，这对一个鉴定有两种以上可能性的情形特别有帮助。该系统的缺陷是不能鉴定罕见菌种，可鉴定16种念珠菌，6种隐球菌，3种毛孢子菌及其他酵母菌共42种。

(二)病原性丝样真菌的鉴定

此大类病原真菌的分类和鉴定传统上仍以形态特征为主要依据，这就要求实验人员要了解和掌握各种菌的菌落形态和镜下结构，并不断实践、观察。最近国内已有较高质量的医学真菌图谱、幻灯片和光盘出版，这对基层从事医学真菌检验的人员很有帮助，可在鉴定时参考。遇有疑难菌种不易鉴定时可送至国家级参考实验室请求协助鉴定，但应注意妥善保存和运输，防止污染和传播。

(三)诊断问题

建立深部真菌病的诊断较困难。一是由于临床表现不特异；二是由于微生物学和血清学试验的结果解释困难。一旦怀疑深部真菌病，必须用尽可能多的标本来源做培养，并努力获得用于镜检的临床材料。

1.念珠菌病的诊断问题念珠菌属的许多成员是口腔或胃肠道的正常居住菌，因此从痰液或粪便标本中分离出念珠菌不能证实诊断。所有怀疑是深部真菌病的病例均应做血培养。从尿液中分离出念珠菌常表明有严重感染，不要再留置尿路导管。在非导管留置患者，首先应确定阴道或会阴的感染并未导致尿液标本的污染。从尿液中分离出热带念珠菌比白念珠菌更提示播散性念珠菌病。从脑脊液中分离出病原菌是念珠菌脑膜炎的可靠证据，但常需大量液体的重复培养。用气管镜获取的支气管分泌物的培养结果较痰培养结果更可靠。

血清学试验：所有怀疑深部念珠菌病的病例均应做血清学检查，但对结果要有合理解释，单独一次沉淀试验阳性结果并不能建立诊断，因为用表面抗原和菌体抗原不能区分是深部感染产生的抗体还是粘膜寄生或感染产生的抗体。同样，一次沉淀试验结果阴性并不能排除免疫低下患者念珠菌感染的诊断，因为这种患者常不能产生可检出的血清学应答。

沉淀素试验：在定期、间隔、连续检测时最有价值。高滴度或滴度升高可提示感染，但此试验对免疫抑制患者无诊断价值。此种情形下可检测循环的白念珠菌抗原。几种迟发凝集试验(LPA)检测白念珠菌Mannan试剂盒已上市。

2.隐球菌病的诊斯问题

(1)显微镜：在艾滋病患者，脑积液中常有大量菌细胞，但荚膜很小，辨认困难。治疗期间脑积液镜检持续阳性说明治疗失败或复发。

(2)培养：用多份脑积液标本培养可提高阳性率。可疑病症应培养至2周。

(3)血清学试验：在疾病早期或感染局限时常可检出针对新型隐球菌的抗体，但在未经治疗的脑积液患者或播散性感染患者则很少检出抗体，此时查抗原更有助于诊断。针对荚膜抗原的迟发颗粒凝集试验(LPA)是目前最可靠的诊断方法之一，因类风湿因子及其他干扰因素已被除去，因此该试验是特异性的，在诊断阶段及治疗阶段所有CSF标本均应做LPA试验，以评价治疗效果。血清抗原水平也可监视治疗反应并与临床评价结合，与CSF抗原水平检测比较，血样更容易获取。有时尽管从CSF中已分离不出病原菌，但检测抗原仍可为阳性反应，这只是反映了已死亡的细胞仍在持续释放抗原，或荚膜抗原从CSF中清除缓慢，而并不意味着感染仍在继续。

3.曲霉病的诊断问题痰涂片的直接镜检常有助于变应性曲霉病的诊断，因为此时常可见到大量的分隔菌丝，其上有特征性的二分叉结构。对疑为侵袭性曲霉病患者，痰的镜检帮助极小，推荐支气管灌洗液标本的检查。尽管从皮损或窦道冲洗液取材的坏死性物质中可检出典型的菌丝，但从培养中分离出病原菌才能确定诊断。急性侵袭性曲霉病最可靠的诊断方法是染色的组织切片检查，发现特征性的无色有分隔菌丝并显示有重复分叉提示曲霉感染。

曲霉感染机体的过程中，其菌体成分作为抗原释放于体液中并刺激机体产生特异性抗体，因此对抗原和抗体的检测有助于诊断。由于患者本身存在严重免疫抑制，无法产生足够浓度的抗体，且抗体的产生需要一定的时间，往往在起病2周后才显著升高，使得抗体检测对于侵袭性曲霉病的早期诊断意义不大，只是对过敏性支气管肺曲霉病和曲霉瘤的诊断有一定价值，多采用放射免疫测定和酶联免疫吸附测定。而对曲霉抗原的测定，其被检测抗原成分主要是半乳糖甘露聚糖(galactomannan，GM)，为曲霉的细胞壁成分。待检的临床标本可以是血清、尿液、脑脊液和支气管肺泡灌洗液，方法有乳胶颗粒凝集反应和ELISA，均有商品化的试剂盒出售。

PCR技术成功地应用于深部真菌感染的诊断性检测已有不少报道。由于该方法可以在短时间内检测微量的真菌DNA，使真菌感染的早期诊断成为可能。检测的靶基因包括高度保守的18S、28SrRNA，单拷贝的肌动蛋白或热休克蛋白基因，线粒体DNA等。保守区序列为真菌共有，选择针对该区域的引物作为真菌通用引物，可扩增出临床常见的各种致病真菌；还可设计出属特异性引物和种特异性引物，分别扩增某属或某种真菌，以指导临床选择敏感的抗真菌药物进行有效治疗。作者近期的研究表明，用以PCR技术为基础的分子诊断方法可快速特异敏感地诊断深部真菌病，在接到临床标本6小时之内可作出鉴定和诊断。

参考文献

[1]刘维达.重视真菌病实验室检查[期刊论文]-中华皮肤科杂志2003(08).

[2]王端礼医学真菌学-实验室检验指南2005.

[3]黄怀球,赖维,张玉清.多点接种真菌培养法在甲真菌病病原学诊断中的应用研究[期刊论文]-中国皮肤性病学杂志2005(09).

[4]朱红梅,温梅,王溪涛.浅部真菌1948份临床标本的真菌学分析[期刊论文]-中国真菌学杂志2006(05).

[5]李筱芳.陈辉.崔凡.聚合酶链反应快速诊断浅部真菌病[期刊论文]-中华皮肤科杂志2005(12).