丙型肝炎病毒抗原检测

丙型肝炎病毒抗原检测

于金三

于金三（茌平县人民医院山东茌平252100）

【中图分类号】R512.6+3【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2010)16-0076-02

【摘要】目的探讨在HCV感染早期，HCVAb为阴性时用酶联免疫法检测HCV核心抗原的试验方法的可行性。方法用重组HCV核心抗原，免疫小鼠制备单克隆抗体，对HCV核心抗原进行酶联免疫法检测。结果HCV核心抗原检测灵敏度高可达5ng/ml，用酶联法对11份HCVAb阴性，HCVRNA阳性标本检测9份阳性。结论酶联免疫法检测HCV核心抗原可作为HCV感染早期的抗原检测方法，较HCVRNA检测法简便、快速，可以作为核酸检测法的一种简易替代方法。

【关键词】丙型肝炎病毒抗原检测

丙型肝炎是严重危害人类健康的传染病之一，它的发病率约7.1/10万，50%以上的HCV感染引起慢性肝炎,其中20%-30%病人可发展为肝硬化.目前全世界HCV感染者超过1亿人，其中我国占4000万,并且呈逐年升高之势，血站、医院、吸毒人员群居地等是HCV的主要传播地，血制品、不洁注射是HCV传播的主要危险因子，其临床预后较差,死亡率较高,发达国家输血后肝炎90%-95%属于这一类.高危带毒人群主要有供血者、吸毒者，高危易感人群主要是输血者、透析患者、吸毒者及医护人员。

HCV－RNA大约由9500－10000bp组成，其基因组排列顺序为5'-C-E1-E2/NS1-NS2-NS3-NS4-NS5-3',能编码一长3014个氨基酸的多聚蛋白前体，可经宿主细胞和病毒自身蛋白酶作用后，裂解成各自独立病毒蛋白，核心蛋白、E1、E2/NS1、NS2、NS3、NS4、NS5。

由于HCV感染通常是持续性的终生感染，抗体检测是一个非常有效的方法，采用核心抗原、NS3、NS4和NS5或多种抗原的嵌合体作为抗原检测相应的抗体是目前酶联法筛查HCV感染最普遍的方法。最近的研究表明，HCV抗体在HCV感染70天之内很难检测到，HCV抗原明显早于抗体的出现，HCV核心抗原的检测，可做为核酸检测HCV感染的一种简易的替代方法[1-5]。

我们使用重组HCV核心抗原，免疫小鼠制备单克隆抗体，建立核心抗原的酶联免疫检测方法。

一材料和方法

1.1材料：HCV重组抗原（1～150aa）,鼠抗HCV核心抗原单克隆抗体、生物素标记鼠抗HCV核心抗原单克隆抗体(惠赠)、亲合素-辣根过氧化物酶结合物、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（SIGMA）、96孔板（NUNC，丹麦）。

1.2方法：鼠抗HCV核心抗原单克隆抗体用0.01mmol/LPH7.4PBS稀释成10ug/ml，加到96孔酶标板中，每孔0.1ml，4OC过夜，次日用含0.05%吐温的0.01mmol/LPH7.4PBS洗三次，加入待检标本，37OC孵育60分钟，用上述洗液洗板三次，加入用含10%牛血清的0.01mmol/LPH7.4PBS稀释的生物素标记抗HCV核心抗体，每孔0.1ml，室温孵育60分钟，同上步骤洗三次，加入用含10%牛血清0.01mmol/LPH7.4PBS稀释的亲合素-辣根过氧化物酶，室温孵育30分钟，同上洗板，加底物液（配制方法：10ml0.5mol/LpH5.0柠檬酸-磷酸缓冲液加入0.1ml1%3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，每孔0.1ml，显色15分钟后加1mol/L硫酸终止反应，在酶标仪上进行检测，检测波长为450nm。

二结果

2．1建立的酶联法检测重组HCV核心抗原，以S/N(标本与阴性对照OD值之比)≥2.0为阳性，此方法的检测灵敏度为5ng/ml。

2．2检测13份HCV抗体阳性标本，核心抗原检测阳性3例，其余为阴性。

2．311例HCVRNA阳性，HCV抗体阴性的血清，用建立的HCV核心抗原酶联免疫检测方法进行检测，其中9例为阳性，2例为阴性。

三讨论

检测HCV抗原的方法一般是检测血清或血浆中HCV的核心抗原，核心抗原位于HCV多聚蛋白的前191个氨基酸。检测血清中HCV核心抗原有两种类型，一种是用于筛选献血员，在HCV感染后抗体出现之前检测出核心抗原，一种是检测HCV感染病人血清中HCV核心抗原的水平用于对抗病毒治疗的监控。作为核酸检定的替代性方法，HCV抗原的检测方法快速简单，不像HCVRNA检测那样需要标本处理,容易出现操作误差。我们建立的HCV核心抗原检测方法，其检测灵敏度可达到5ng/ml。在检测HCV病人中，13例HCV抗体阳性血清仅检测出阳性3例，检出率较低的原因可能是由于有抗体的存在干扰了抗原的检测，因为标本中的抗体可能与用于核心抗原检测的单克隆抗体竞争结合抗原。为了避免这种干扰，需要对单克隆抗体作进一步筛选。HCVRNA检测阳性而HCV抗体阴性的标本，为HCV感染的早期，11例标本中有9例为阳性，由于酶联法操作简便，成本低，可重复性好，可作为早期感染的一种筛选方法。

酶联免疫法检测HCV核心抗原，较核酸检测法方法更简便、快速，结果与核酸检测法比较无显著差异,可作为HCV感染早期替代核酸检测法的一种HCV抗原检测方法。

参考文献

[1]Aoyagietal.JClinMicrobiol37:1802,1999.

[2]Dawsonetal.TransfusionSD161,40,2000.

[3]Dicksonetal.,Transplantation68:1512，1999.

[4]Tanakaetal.,Hepatology32:388，2000.

[5]Tanakaetal.,JHepatol23:742，1995.