免疫印迹法检测1型糖尿病自身抗体的临床应用价值评价

免疫印迹法检测1型糖尿病自身抗体的临床应用价值评价

黄印翔

(厦门大学附属第一医院福建厦门361000)

【摘要】目的：为了进一步探讨免疫印迹法在检测1型糖尿病自身抗体当中的临床应用价值。方法：我院就诊的1型糖尿病患者86例和在此期间来我院进行体检的健康患者86例，共计172例相关资料。结果：免疫印迹法检测（IB）对86例1型糖尿病患者进行检查总阳性率（敏感性）为93.02%；对86例健康对照组进行检查特异性为97.67%。酶联免疫吸附法（ELISA）对86例1型糖尿病患者进行检查总阳性率（敏感性）为97.67%；对86例健康对照组进行检查特异性为87.21%。对两种检测方法进行比较，IB检测l型糖尿病患者自身抗体的总阳性率（敏感性）明显低于ELISA法，差异具有统计学意义(P<0.05)，而IB检测l型糖尿病患者自身抗体的特异性明显高于ELISA法，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：免疫印迹法在检测1型糖尿病自身抗体当中具有显著的临床应用价值，值得推广。

【关键词】免疫印迹法；1型糖尿病；酶联免疫吸附法

【中图分类号】R587.1【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2017）04-0126-02

糖尿病的早期分型在胰岛素的治疗方面以及1型糖尿病的早期免疫干预方面具有非常重要的临床价值[1]。在1型糖尿病患者的血清当中存在了三种自身免疫标志物，分别为胰岛细胞抗体(ICA)、谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)、胰岛素抗体(IAA)，这三种自身免疫标志物在糖尿病分型、糖尿病的研究、糖尿病的预测等方面具有重要的地位和作用[2-3]。为了进一步探讨免疫印迹法在检测1型糖尿病自身抗体当中的临床应用价值，本研究总结在我院就诊的1型糖尿病患者86例和在此期间来我院进行体检的健康患者86例，共计172例相关资料，现将结果报道如下：

1.资料与方法

1.1一般资料

研究对象为2014年2月-2016年3月期间在我院就诊的1型糖尿病患者86例和在此期间来我院进行体检的健康患者86例，共计172例，年龄范围为11岁～49岁，平均年龄为（31.4±6.7）岁，体重范围为31kg～72kg，平均体重为（66.8±7.1）kg，研究对象纳入标准：所有患者均符合1998年世界卫生组织规定的1型糖尿病诊断标准；体检的健康者空腹的血糖值必须在正常范围内。所有的1型糖尿病患者和体检健康者均同意参与本研究调研工作。研究对象排除标准：排除妊娠期者，排除合并严重高血压者，排除严重肝脏功能受损者。分组方法：选择我院进行体检的健康患者86例为对照组，选择我院就诊的1型糖尿病患者86例为观察组，两组受调查人员的一般资料（平均体重、性别比例、平均年龄等）经统计学检验，结果显示差异无统计学意义（P>0.05），说明具有可比性。

1.2方法

1.2.1采血参与本次研究的人员在清晨均需空腹进行静脉采血，在37℃的环境当中放置半小时，然后3000r/min进行离心10min，将血清分离出来，在-20℃的条件下储存，备用。

1.2.2抗体的测定一是免疫印迹法（IB）：采用购买于深圳伯劳特生物制品有限公司的试剂盒对ICA、GADA、IAA进行测定。（1）将试剂盒取出放置在室温下进行平衡，将1ml的工作液加入到反应槽（内部含印迹膜条）当中，保持水平方式进行震荡5min之后，将10μl的待测血清加入其中，然后继续保持水平震荡30min；（2）将反应槽当中的液体倒弃，将1ml的洗涤液加入反应槽当中洗涤约5min然后将液体倒弃，每个反应槽都必须反复洗涤3次。（3）每个反应槽当中均加入1ml的工作液和20μl的酶联试剂，将反应槽放在水平振荡器上，震荡30min。（4）再次洗涤反应槽，将反应槽当中的液体倒弃，将1ml的洗涤液加入反应槽当中洗涤约5min然后将液体倒弃，每个反应槽都必须反复洗涤3次。（5）每个反应槽当中均加入1ml的显色试剂，将反应槽放置在水平震荡器上方，震荡10min。（6）发现清晰的显色之后，将反应槽当中的显色试剂倒弃，并用清水进行反复冲洗。（7）将反应槽当中的印迹膜条取出，晾干，同标准带进行对比，判定检查结果。二是酶联免疫吸附法（ELISA）：采用购自美国Biomerica公司的试剂盒对ICA、GADA、IAA进行测定。（1）试剂盒保存在2～8℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。（2）将50μl用碳酸盐包被缓冲液稀释的待测血清加入96孔酶标板中，用塑料膜板将孔板覆盖后置于室温2h或过夜。（3）弃去反应液用洗涤液洗涤3次，轻拍孔板使洗涤液甩干。（4）封闭每孔中加入200μl封闭液，盖上膜板，室温封闭至少2h。（5）封闭后用磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤两次。（6）每孔加入稀释好的待测血清100μl，室温孵育2h并过夜，孵育后用洗涤液洗涤4次。（7）检测每孔加入100μl的底物溶液，待显色充分后加入100μl的终止液并在酶标仪上进行检测。

1.3统计学方法

选择spss19.0统计学软件包进行数据分析，组间计数资料比较方法选择χ2值检验，以P<0.05为差异具有统计学意义的标准。

2.结果

免疫印迹法检测（IB）对86例1型糖尿病患者进行检查总阳性率（敏感性）为93.02%；对86例健康对照组进行检查特异性为97.67%。酶联免疫吸附法（ELISA）对86例1型糖尿病患者进行检查总阳性率（敏感性）为97.67%；对86例健康对照组进行检查特异性为87.21%。对两种检测方法进行比较，IB检测l型糖尿病患者自身抗体的总阳性率（敏感性）明显低于ELISA法，差异具有统计学意义(P<0.05)，而IB检测l型糖尿病患者自身抗体的特异性明显高于ELISA法，差异具有统计学意义(P<0.05)。具体数据分析见表。

3.讨论

免疫印迹法（IB）是一种新型的免疫技术，其属于分子生物学，是由免疫学的特异性反应结合凝胶电泳高分辨率建立而成的，其原理是通过对聚丙烯酰胺凝胶电泳进行借助进而把蛋白质等生物活性物质高效的分离出来，进行分离之后得到的蛋白质可以经过电转印到硝酸纤维膜上，同时其仍然保持较高的分辨率，而且抗原性也保持在原有状态，这样就更加有利于进行各种类型的扫描、识别、控制以及保存[4-5]。

本次研究显示，免疫印迹法检测（IB）对86例1型糖尿病患者进行检查，ICA、GADA、IAA的阳性率分别为69.77%、67.44%、23.26%，总阳性率（敏感性）为93.02%；对86例健康对照组进行检查，ICA、GADA、IAA的阳性率分别为1.16%、1.16%、0.00%，特异性为97.67%。酶联免疫吸附法（ELISA）对86例1型糖尿病患者进行检查，ICA、GADA、IAA的阳性率分别为72.09%、81.40%、41.86%，总阳性率（敏感性）为97.67%；对86例健康对照组进行检查，ICA、GADA、IAA的阳性率分别为4.65%、5.81%、2.33%，特异性为87.21%。对两种检测方法进行比较，IB检测l型糖尿病患者自身抗体的总阳性率（敏感性）明显低于ELISA法，差异具有统计学意义(P<0.05)，而IB检测l型糖尿病患者自身抗体的特异性明显高于ELISA法，差异具有统计学意义(P<0.05)。综上所述，IB法能够在同一时间对三种自身抗体进行检测，操作简单并且具有较高的重复性，是一项简单有效的抗体检测方法，值得在临床上推广应用。

【参考文献】

[1]何应中，魏琳丹，韩昵薇等.糖尿病患者GADA和IA-2A定量检测的诊断评价[J].贵州医药，2015，(5):448-449.

[2]冯春颜，张永顶，胡纪文等.免疫印迹法检测1型糖尿病自身抗体的临床应用[J].国际检验医学杂志，2009，30(6):593-594.

[3]徐晶.免疫印迹法检测1型糖尿病自身抗体的评价[J].中外健康文摘，2013，(37):74-75.

[4]胡纪文，熊建辉，张永顶等.免疫印迹试验检测血清胰岛自身抗体的应用价值[J].重庆医学，2013，42(20):2413-2414.

[5]杨洪生，卢锡基，于涛等.1型糖尿病小鼠肠道潘氏细胞的杀菌功能改变[J].新医学，2016，(1):22-26.