去卵巢大鼠成骨细胞雌激素受体表达的研究

去卵巢大鼠成骨细胞雌激素受体表达的研究

覃淑云1蔡科军1冯照善1韦启后2

覃淑云1蔡科军1冯照善1韦启后2

(1广西柳州医学高等专科学校545006；2广西柳州市疾病预防控制中心545007)

【中图分类号】R58【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2011）3-0145-03

【摘要】目的观察研究去卵巢SD大鼠成骨细胞内雌激素受体（ER）表达水平的变化规律。方法SD雌性大鼠随机分为正常对照组和去卵巢（OVX）后第5周组、第7周组；采用二次酶消化、反复贴壁法分离纯化培养大鼠颅骨成骨细胞，进行钙钴法碱性磷酸酶（ALP）染色，I型胶原免疫组化染色来观察、鉴定大鼠成骨细胞。应用半定量Westernblot对各组SD大鼠成骨细胞内雌激素受体进行检测。结果通过ALP染色、I型胶原免疫组化及形态学观察符合成骨细胞特征。Westernblot显示雌激素受体表达OVX组明显低于正常组，第7周组低于第5周组。结论随着去卵巢后时间延长，成骨细胞表达的雌激素受体下降，骨质疏松风险变大。

【关键词】去卵巢大鼠雌激素受体Westernblot

骨质疏松症(OP)是一种常见的常见的全身性骨骼疾病,其发病与多种因素有关，具体发病机制尚未清楚。随着分子生物技术的的应用，在人们发现雌激素受体（ER）后并深入研究后，获知雌激素是通过雌激素受体发挥作用的,雌激素对骨代谢的作用点在成骨细胞[1]。雌激素属于类固醇激素,通过细胞内受体发挥作用,雌激素受体是介导雌激素发挥生物效应的生物大分子。本文通过研究去卵巢大鼠成骨细胞内雌激素受体的表达规律，探讨雌激素受体在去卵巢大鼠骨质代谢活动中的作用机制，为骨质疏松的研究提供一些新的实验依据。

1.材料与方法

1.1动物的分组与处理

选用40只SD雌性大鼠，15周龄，体重(205±15)ｇ，随机分为去势组和对照组，其中去势组又分为第5周和第7周两个时间组，每组20只SD大鼠。去势组大鼠均用1%戊巴比妥钠腹腔内麻醉(30mg/kg)，下腹部切口，去势组行双侧卵巢切除术，而对照组仅行开腹术。各组大鼠分笼饲养，标准大鼠饲料，自由进水、进食。

1.2研究方法

1.2.1大鼠成骨细胞的分离与培养

术后分别在第5、第7周处死大鼠，在无菌条件下取大鼠颅骨，剪碎后放入含有青霉素和链霉素溶液处理15min后,用Hank，s液充分冲洗以去除血细胞成分至骨片发白为止。用0.1%I型胶原酶覆盖骨块，消化20min，吸弃上清及消化掉的细胞，用眼科手术剪将骨块剪碎，加入0.1%I型胶原酶消化30min，透过纱布吸取消化液，移至装有DMEM的离心管中终止消化，再次加入0.1%I型胶原酶消化30min，重复消化共3次，将获得的细胞用Hank液洗2次，悬浮于含10%胎牛血清的DMEM中，调整细胞浓度至104～105个/ml，接种于中培养瓶中，置5%CO2、37℃培养箱中培养，3～5d换液，细胞长致融合状态时消化传代（1：2）。

1.2.2成骨细胞的纯化

用反复贴壁法去除呈选为细胞。将细胞悬液在培养前先接种到一玻璃培养瓶内,静置10min左右,然后轻轻吸取上清液于另一培养瓶中再静置,重复此过程2～3次,最后仍悬于培养液中的即为纯化的成骨细胞。

1.2.3细胞形态的观测

采用倒置相差显微镜每日观察细胞的生长情况及形态特征

1.2.4钙钴法细胞ALP染色

将爬满细胞的盖玻片在4%多聚甲醛中固定10～15min，进行染色并计算阳性细胞百分率。

1.2.5免疫组化法检测I型胶原

取爬满细胞的盖玻片，按试剂盒说明步骤操作；显微镜观察并计数阳性细胞百分比。

1.2.6应用半定量Westernblot酶促底物染色法以及发光法（ECL)对各组SD大鼠成骨细胞内雌激素受体进行检测，Imagepro图像处理系统对结果进行分析。

1.3统计学处理

采用SPSS15统计软件包进行分析，样本均数t检验对结果进行统计分析,P<0.05有统计学意义。

2．结果

2.1成骨细胞形态

原代细胞贴壁前呈均匀一致的球形,细胞周围有光晕,细胞核偏于一侧,可见清晰的核仁;24h后开始贴壁,48～72h完全贴壁伸展,呈饱满多角状。随着培养延长,细胞伸出较多突起,有的突起相互连接,培养两周细胞融合成片,细胞形态为单核梭形,胞浆丰富,呈“铺路石”样排列。当细胞重叠生长时,部分细胞脱离瓶壁,萎缩成圆球状,漂浮于培养液中。

2.2碱性磷酸酶(ALP)染色

经钙-钴法细胞化学染色后,镜下见87%的成骨细胞胞浆内棕褐色阳性颗粒,细胞密集处阳性率更高，而ALP染色阴性细胞呈均匀一致的淡红色。

2.3免疫组化法检测I型胶原

成骨细胞胞浆呈棕黄色阳性着色，阳性细胞比例为87%。

2.4Westernblot检测结果

运用Westernblot酶促底物染色法以及发光法,正常组与去卵巢组SD大鼠成骨细胞内ER表达情况表1、表2。第7周组ER的表达要比第5周组低，去卵巢组要比正常组低。

表1Westernblot染色法测定雌激素受体ER的表达结果(光密度值)

3.讨论

雌激素受体的检测方法有很多,如生化法、亲和组化法、免疫组化法以及蛋白印迹法(Western-blot检测)。本实验采用的是Westernblot酶促底物染色法以及化学发光法。Western-blot技术是检测细胞内蛋白质表达的专用技术,其方法具有凝胶电泳分辨率高和固相免疫测定的特异敏感等多种优点,可以从混杂抗原中检测出特定的抗原,但由于其检测系统通常采用酶促底物显色法,其灵敏度低、且显色缓慢而使其应用受到一定限制，本实验将Western-blot的特异性和化学发光法的灵敏度结合起来,提高了Western-blot技术的灵敏度。

1964年Peck等[2]首次将胎鼠骨组织内所含有成骨细胞用于体外培养,开创了成骨细胞体外培养用于骨代谢研究的新纪元。以培养的成骨细胞作为研究模型可用来观察各种生长因子对培养的成骨细胞功能活动的影响。目前认为成骨细胞具有以下方面的功能:分泌Ⅰ型胶原,形成骨矿化基质;对某些内分泌激素反应,改变骨的代谢活动;大量的AKP分泌是成骨细胞的另一特征。本研究通过免疫组织化学法检测Ⅰ型胶原，以及对成骨细胞形态学的观察和碱性磷酸酶染色,证明本实验收集的用于研究的细胞群符合成骨细胞的特征。

Eriksen等[3]在体外培养的成骨细胞样细胞系中采用放射性配基分析等方法检测出具有高亲和力的雌激素受体(estrogenreceptor),提出雌激素可能作用于成骨细胞上的雌激素受体从而影响骨代谢,传统的雌激素受体称为ERα。最近研究发现雌激素受体存在第二种亚型,命名为ERβ[4]。人雌激素受体α基因定位于6号染色体长臂25?1区(6q24-q27)[5]含有8个外显子和7个内含子,全长140kb[6];编码66Kda的含有595个氨基酸的蛋白质。人雌激素受体β基因定位于14号染色体长臂(14q22-q24)由40kb碱基构成;编码530氨基酸的蛋白质。目前已初步了解ERα和ERβ在骨的不同分布,但对其作用机制尚不清楚。Onoe等[7]研究发现,ERβmRNA在骨中的高水平表达类似于在子宫和睾丸的表达,但低于在卵巢和前列腺的表达;ERβmRNA在股骨干骺端和腰椎的松质骨表达高于股骨干皮质骨。OVX引起雌激素缺乏最先诱导松质骨的骨吸收。因此雌激素很可能主要在松质骨调节骨重建。ERβ在松质骨表达水平明显高于皮质骨并且ERβ水平在雌雄大鼠中相等。这些结果表明,雌激素通过ERβ介导在骨中所扮演的角色是理解绝经后骨质疏松发病机制的基础。在人成骨细胞分化期,ERα和ERβ的表达也是不同的[8]。实验表明:在人SV-HFO成骨细胞系培养期,ERβmRNA表达逐渐递增,在第21天达到最高,ERβmRNA表达较第6天平均高99±53倍。相比之下,ERα表达到第10天才略有提高,然后一直维持这个水平。nam等[9]用RT-PCR的方法进一步观察到,雌激素受体mRNA水平在成骨细胞增值初期较低,当碱性磷酸酶出现时,雌激素受体mRNA表达迅速增强,到骨钙素分泌达到最高峰时,其水平达最大值。证实了雌激素受体在成骨细胞中的作用具有时相性及量效关系。Sutherland等[10]用蛋白质印迹及RNA印迹方法证明,在人成骨样SaOS-2细胞存在雌激素受体,而且碱性磷酸酶的活性与其水平有关,并指出雌激素并不影响雌激素受体mRNA的水平,有可能是通过提高其移动的速率及抑制其降解来提高雌激素受体。

本实验通过制作去势SD大鼠模型，用Westernblot酶促底物染色法以及化学发光法检测大鼠成骨细胞的雌激素受体的表达显示第7周去势组的表达明显比第5周去势组低，OVX组又明显低于正常组，提示雌激素对雌激素受体有正调节作用。但是骨质疏松发病机制是多因素导致的，包括各种细胞因子、免疫反应都参与其中，至于雌激素与细胞因子之间与骨质疏松的关系我们将进一步研究。

参考文献

[1]黄洁,程云英.大鼠成骨细胞的体外培养和生物学特性的研究[J].南京铁道医学院学报,2000,19(2):88-90.

[2]PeckWA,BingeSJ,FedakSA,etal.Science,1964,1463:1467.

[3]Eriksen,ColvardE,BergK,etal.Evidenceofestrogenreceptorsinnormalhumanosteoblast-like.Cell,Science,1988,241:84-87.

[4]KuiperGG,EnmarkE,Pelto-HuikkoM,etal.Cloningofanovelestrogenreceptorsexpressedinratprostateandovary.ProcNatAcadSciUSA,1996,93:5925-5930.

[5]OzOK,HirasawaG,LawsonJ,NanuL,ConstantinescuA,AntichPP,MasonRP,TsyganovE,ParkeyRW,ZerwekhJE,SimpsonER2001Bonephenotypeofthearomatasedeficientmouse.JSteroidBiochemMolBiol79:49-59.

[6]KuiperGG,EnmarkE,Pelto-HuikkoM,NilssonS,GustafssonJA1996Cloningofanovelreceptorexpressedinratprostateandovary.ProcNatlAcadSciUSA93:5925-5930.

[7]OnoeY,MiyauraC,OhtaH,etal.Expressionofestrogenreceptorβinratbone.Endocrinology,1997,138:4509-4512.

[8]ReidIR,LeggeM,StapletonJP,etal.Regularexercisedissociatesfatmassandbonedensityinpremenopausalwomen.JClinEndocrinolMetab,1995,80:1764-1768.

[9]NamK,MarshallP,WolfRM,CornellW2003Simulationofthedifferenbiologicalactivitiesofdiethylstilbestrol(DES)onestrogenreceptorandestrogen-relatedreceptor.Biopolymers68:130-138.

[10]SutherlandMK,HulDU,RaoetalLG.ImmunohistochemicallocalizationoftheestrogenreceptorinhumanosteoblastSaOScells:AssociationofreceptorlevelswithAlkallinePhosphataseactivity.Bone,1996,18:361-369.

基金项目：广西壮族自治区教育厅科研基金资助项目（编号：2008C114）