灭活乳酸菌对鲜肉的护色效果研究

灭活乳酸菌对鲜肉的护色效果研究

李丽琴1李潮光2陈惠俏3

李丽琴1李潮光2陈惠俏3

（1.3.华南农业大学食品学院，广东广州529330；2.广东药学院，广东广州510006）

中图分类号：R378.992文献标识码：A文章编码：1003-2738（2012）06-0328-03

摘要：在肉制品加工中，亚硝酸盐起着发色，赋予特殊风味和抑菌的作用，但因其毒性较大和容易形成致癌物质，人们一直在寻找替代品，乳酸菌是一个很有潜力的代表。目前国内外对乳酸菌的研究都集中在对腌制肉的发色作用上，它们对鲜肉是否也有同样的护色效果，尚没有定论；而且人们尚未对微生物的肉制品发色机理完全了解，不能广泛地推广和应用。

鉴于上述原因，本论文探讨了一株从实验室自制腌肉分离、对鲜肉有护色作用的唾液乳杆菌H的灭活条件，并利用不同灭活条件下处理得到的粗酶液用于鲜肉的护色，以及利用超声波细胞破碎技术从菌体中提取亚硝酸盐还原酶和一氧化氮合成酶，测定了不同处理下粗酶液的酶活旨在了解发色机理，并探讨乳酸菌对鲜肉的护色的可能性。

关键词：鲜肉护色；灭活乳酸菌；一氧化氮合酶

StudiesofInactivatedLactobacillusonFreshMeat-ColorProtection

Abstract:Nitriteplaysanimportantroleinformingspecialflavorandantibacterialeffectinmeatprocessing,butitiseasytogeneratetoxicityandcancer-causingsub-ammoniumnitrate.TheUnitedStatesNationalAcademyofSciencesconsidersthefollowingalternativesarethemostpromising:ascorbicacidsalt,amixtureofnitrite,radiation,lactobacillusandhypophosphite.Studyhavefocusedonlactobacillusaboutcolor-protectionofsaltedmeat(fermentedmeat),butnoconclusioniftheyhavethesameeffectonfreshmeat(non-fermentedmeat).Peoplestilldonotknowthemechanismanditcannotbewidelypromotedandapplied.Forthesereasons,thisthesisdiscussesinnovativemethodtofindthemechanismofcolor-protectionoffreshmeat

Keywords:color-protectionoffreshmeat;inactivateLactobacillus;nitricoxidesynthasenitritereductase

一、前言

（一）乳酸菌在肉类护色中应用的研究进展。

乳酸菌用于肉制品加工,可以改善肉制品的色泽和风味，延长货架期；提高肉品安全性[1]。在肉制品加工中加入乳酸菌,其颜色鲜艳度更好,红色色素更稳定。乳酸菌不仅具有一般微生物所产生的有关酶系,而且还可产生一些特殊的酶系[2],如分解亚硝胺的酶系、控制内毒素的酶系等。另外乳酸菌还可以减少亚硝胺的生成,降低亚硝酸盐残留，还能降低pH值,促进亚硝酸盐的还原作用,从而使亚硝酸盐分解,大大降低亚硝酸盐残留量,进一步减少了残留致癌物质。

研究发现，利用生物发酵技术[3]，把乳酸菌接种到原料肉中，不仅能使肉发色，抑制其他腐败菌生长，还可以降低成本和亚硝酸含量，经实验证明亚硝酸盐的添加量仅为原来的0.01%~0.006%；还可以降低pH，减缓变质。

Moler等(2003)[4]将发酵乳杆菌JCM1173和IFO3956应用到无硝发酵肠生产中，获得了稳定的腌肉颜色。本研究对实验涉及的乳酸菌进行了灭活条件摸索，结合前期实验，探讨灭活乳酸菌制剂对鲜肉护色的可行性。

（二）实验方法。

1.实验设计。

实验肉块随机分成8组，每组12块；采用5种不同的灭活方法对H菌进行灭活，分别为超声波破碎，热灭活，微波灭活，反复冻融，溶菌酶处理，同时作三个对照：无菌水，亚硝酸钠、磷酸缓冲液。

2.指标测定：色差测定，光谱扫描[6-8]

3.不同灭活处理下乳酸菌中酶活测定：一氧化氮合酶活性的测定[9-12]

二、结果与分析

（一）色差测定。

用色差计分别测定各组样品的三相颜色坐标值，即明度值(L值)，红度值(a值)和黄度值(b值)。结果如下图所示：

图1不同灭活菌悬液处理猪肉的L值随时间的变化

图2不同灭活菌悬液处理猪肉的a值随时间的变化

图3不同灭活菌悬液处理猪肉的b值随时间的变化

从图1、图2和图3可看出，总体上，各处理组的b值差异不明显，在6-8之间。各处理组的L值与a值的差异较明显，随着时间的变化，L值和a值发生的变化也较大，而且随着时间的变化，总体L值降低，而a值即肉的红度具有较明显的差异。3组（磷酸缓冲液组）、4组（超声波灭火组）、5组（反复冻融组）与对照组1组、2组对比，第一天，3组、4组、5组的a值分别为15.3、13.97、13.9，而空白对照组仅为10.01，随着存放时间的延长，各组的a值都有所下降，但4组（超声波灭火组）和5组（反复冻融组）下降不大，到了第三天，仍然高达14.15和12.45，与其他各组差异显著，这与感官评定结果有一定的相似性。综合来看，灭活H菌所处理的鲜肉有良好的护色效果，在各种不同的灭活方法中，超声波灭活方法效果最好。

（二）光谱扫描。

杨锡洪[13]等（2005)研究发现，肉的颜色主要取决于肉的物理结构、色素的化学状态和色素浓度。肉的颜色实质上是内在特性的外在表现，与肉的其它品质如保水性、pH值、肉的风味和肉的营养品质等都有直接的关系。肉中的肌红蛋白以多种形式存在，肌肉颜色的变化主要取决于肌红蛋白的含量和其所处的状态，且每种肌红蛋白衍生物都有其特征吸收光谱，通过各种吸收光谱可以确定肉中肌红蛋白的化学状态及含量。

竺尚武等(1993)描述纯氧合血红蛋白的特征波长在542nm，577nm处各有一个吸收峰，在561nm处有一个低谷；汤祥明（2006）等描述纯高铁肌红蛋白在波长为505nm和630nm处分别有特征吸收峰。

图4未经处理的鲜肉放置0d后的光谱扫描结果

在实验前，随机取两块约10g的鲜肉用绞肉机搅碎，并用磷酸缓冲液提取其中的肌红蛋白衍生物（提取方法参照2.2.3（3））。可见光图谱扫描如图7所示。可以看出，，随机抽取的两块肉在450nm-650nm范围内的吸收曲线与氧合肌红蛋白的吸收峰一致，且两条曲线基本重合，说明随机抽取的肉块之间肌红蛋白含量相差无几，即肉色无显著差异。因此可排除肉块本身之间的差异对各处理的护色效果造成的差异。

图5各处理猪肉放置1d后的光谱扫描结果

从图8中可以看出，除了空白对照组无菌水组以及NaNO2组外，其他处理组均有典型的NOMb吸收光谱，磷酸缓冲液组也出现了同样的情况，即在540nm和580nm附近各有一个吸收峰且540nm处的吸收更强。其中磷酸缓冲液组最高，其次是超声波组微波灭活组热灭活组溶菌酶组反复冻融组。而空白对照组无菌水组以及NaNO2组在这两个波段的吸收峰已经消失，说明空白对照组中无NOMb存在。

图6各处理猪肉放置2d后的光谱扫描结果

各处理猪肉放置2d后，其可见光谱吸收较第一天发生了较大的变化，见图9。其中，磷酸缓冲液组，超声波组保持原有的NOMb吸收曲线，但是吸收值较第一天都有所下降。空白对照组无菌水组和NaNO2依然没有NOMb吸收光谱，磷酸缓冲液组在540nm和580nm处的峰值最高，峰值几乎没有变化。其次是热灭活组超声波组反复冻融组溶菌酶组微波灭活组。

超声波组、微波灭活组，溶菌酶组在580nm处的吸光值由原来的0.487、0.453、0.371下降为0.448、0.331和0.319，下降了8%、31.3%和14%；540nm处的吸光值由原来的0.474、0.524、0.412下降到0.345、0.337和0.372，下降了27%，35%和9%。反复冻融组和热灭活组出现了峰值上升的趋势，在580nm分别从0.349、0.435上升到和0.36和0.472，上升了2.5%和8.5%；在540nm分别从0.379、0.478上升到0.391和0.509，上升了5%和6.4%。

图7各处理猪肉放置3d后的光谱扫描结果

放置3d后，不难看出，除了无菌水组和NaNO2组没有吸收峰外，其他组仍然有吸收峰特征。同时可以清楚的看出超声波组反复冻融组溶菌酶组磷酸缓冲液组热灭活组微波灭活组。各处理组在580nm处吸收值较第二天都有了一定的下降；而在540nm处除了超声波组和反复冻融组上升外，其他处理组较第二天也有了一定的下降。

（三）一氧化氮合酶的活性分析。

1.NADPH标准曲线的绘制。

当L-精氨酸在NOS（一氧化氮合酶）催化下转化成L-胍氨酸的过程中，NADPH被氧化成NADP。通过测定340nm处NADPH特征吸收值的减小，计算NADPH消耗的物质的量，从而推测NOS的活性。

表8不同浓度NADPH溶液与吸光度的关系

以NADPH的浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制NADPH标准曲线图，结果如图9所示：

图9NADPH标准曲线图

标准曲线的回归方程为y=0.1308x-0.1349，相关系数R2=0.9982。

2.不同灭活乳酸菌的NO合成酶活性测定。

以不加L-精氨酸的样品作为对照，在酶促反应30min后，于340nm处测量加入酶液后样品的吸光度。根据一氧化氮合酶标准曲线y=0.1308x-0.1349，查得相应的NADPH浓度，并计算出相应NADPH摩尔量。

根据酶活的定义：在30℃，pH为7.0的条件下，每分钟（min）转化1nmolNADPH所需的酶量（mL）为一个酶活单位（U），即

lU=1nmol/mL/min，U=CNADPH×VNADPH×T/V酶

式中，CNADPH为NADPH摩尔浓度，VNADPH为NADPH体积（10mL），T为酶促反应时间（30min），V酶为酶液体积（0.5mL）。经计算可得出：

表10不同灭活处理的乳酸菌细胞中的NO合成酶活性

不同灭活处理菌体细胞酶活(nmol/mL/min)

超声波灭活282.6

热灭活—

反复冻融—

微波灭活—

溶菌酶灭活546

由结果可以看出，在不同的灭活方法中，溶菌酶提取的粗酶液里测得的NOS酶活性最高，高达546，超声波破碎法次之，而热灭活、反复冻融和微波灭活法提取的粗酶液已经失去了酶活性。由此可以推测，NOS在60℃的灭活温度下无法维持活性，反复冻融对酶的损伤过大，微波灭活法令酶活性中心失水过多而失活。

参考文献：

[1]金文刚,师文添,张海峰.新型肉制品发色剂的研究进展[J].肉类工业,2007,(12):41-43。

[2]张庆芳,迟乃玉,郑燕等.乳酸菌降解亚硝酸盐机理的研究[J].食品与发酵工业.2002,(08):66-72。

[3]黄聪亮,李凤林.乳酸菌制剂的研究与发展现状[J].安徽农学通报.2007,(16):36-39。

[4]M?ller,J.K.S.,Adamsen,C.E.,Catharino,R.R.,Skibsted,L.H.,&Eberlin,M.N..Massspectrometricevidenceforazincporphyrincomplexastheredpigmentindry-curedIberianandParmaham[J].MeatScience.2007,(75):203-210。

[5]郑怀忠.产亚硝酸还原酶菌株发酵特性及酶在肉制品中的应用.集美大学.2009,(8):23-27。

[6]那淑敏,贾士芳,陈秀珠.嗜酸乳杆菌产生的广谱抗菌肽AP311的分离和鉴定[J].微生物学报.2001,(4):494-498。

[7]HuangMK,YJChoi,R.Houde,etc.Effectsoflactobacilliandanacidophilicfungusontheproductionperformanceandimmuneresponsesinborilerchickens.PoultryScience.2004,(83):788-795。

[8]胡文锋,郭增雄,方祥.热灭活嗜酸乳杆菌及其多肽类抗菌物质特性研究[J].饲料博览.1999,(11):7-8。

[9]胡文锋,方祥,张辉华等.乳酸菌翻分离,鉴定及其生长特性[J].中国微生态学杂志.2000,(13):35-38。

[10]马凤琴,徐广泽.中国肉食制品加工大全[M].北京:北京理工大学出版社.1993,(8):1-12。

[11]Vural,H.TheuseofcommercialstarterculturesintheProductionofThrkishsemi-dryfermentedsausages.ZLebensmUntersForschA.1998,(207):410-412。

[12]Chen,Y,Rosazza,J.P.N.Purificationandcharacterizationofnitricoxidesynthase(NOSnoc)fromaNocardiaspecies[J].JournalofBacteriology.1995,(177):5122-5128。

[13]杨锡洪.以血红蛋白制备腌制色素替代亚硝酸钠发色的研究[博士学位论文].江南大学.2005,38-43。

作者简介：

1.李丽琴（1987-），女，汉，广东广州，华南农业大学食品学院，学士学位，研究方向，食品生物工程。

2.李潮光（1992-），男，汉，广东广州，广东药学院，学士学位，研究方向，药物化学。

3.陈惠俏（1987-），女,汉，广东罗定，华南农业大学食品学院，学士学位，研究方向，食品生物工程。