速率法检测G6PD活性及影响因素探讨

速率法检测G6PD活性及影响因素探讨

朱剑霞朱辉文胡淑芬黎毓光谭冬梅李秋娴

朱剑霞朱辉文胡淑芬黎毓光谭冬梅李秋娴（广州市番禺区中心医院检验科广东广州511400）

【摘要】目的探讨在本实验室的实验条件下，以速率法检测G6PD活性，初步得出本实验室G6PD缺乏患者的活性范围；探讨速率法检测G6PD活性的阳性率及其影响因素；探讨速率法与其他检测方法的相关性。方法采集自2011年1月至2011年11月本院门诊患者和住院患者标本共4625例,采用速率法测定G6PD活性,随机抽取640例标本采用美兰法及荧光斑点法做对照。结果（1）本实验室用速率法检测G6PD缺乏的活性范围为<600U/L；（2）速率法检测G6PD的阳性率为6.72%；（3）速率法检测G6PD活性的阳性率明显低于美兰法，其差别具有统计学意义（P<0.01）。结论(1)本实验室G6PD缺乏的活性范围略高于说明书的参考值；（2）速率法测定G-6-PD酶活性阳性率6.72%,但阳性结果一定要进行复查，以防假阳性；（3）速率法与美兰法检测G6PD，结果有明显差异。

【关键词】G-6-PD速率法美兰法全自动生化分析仪

【中图分类号】R446.9【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）03-0014-01

引言

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症是一种遗传代谢性疾病,有效筛查G6PD缺乏症患者对于有效预防相关溶血性疾病的发生有重要作用,其中G6PD活性检测是筛查G6PD缺乏症的重要手段。以往G6PD活性采用高铁血红蛋白还原实验(美兰法),操作起来比较费时费力,且人为因素引起的误差较大.近年来,不断有新的操作方法推出,如荧光斑点法[1]、速率法、G6PD/6PGD比值法等。

高铁血红蛋白还原试验法（美兰法）曾是国内最常用的方法之一,该法最终是通过颜色的变化,应用比色计比色来反映红细胞G6PD的活性，但该法易于出现假阳性结果,特别是在不稳定血红蛋白、高脂血症等情况下,且半合子或纯合子的敏感性和特异性较高[2],罕见假阴性,即凡有酶活性缺乏者,不论是中间数值还是显著缺乏者均可检出[3]。

荧光斑点法是国际血液学标准化委员会（ICSH）推荐的方法，具有较好的敏感性和特异性，缺点是对试剂要求较高，用肉眼判断结果的一些主观性偏差和对杂合子检出率不高。荧光斑点法用于男性G6PD缺乏的检出可信度较高。

速率法又称连续检测法，是指在多个时间点连续监测产物（或底物）在线性范围内的生成量（或消耗量）即零级反应速率测定酶活性的方法。本实验室从2011年采用速率法检测G6PD活性。为得到在本实验室的条件下G6PD缺乏患者的活性范围、阳性率及影响因素，特进行本研究。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1标本来源：

1.1.1.1采集自2011年1月至2011年11月本院门诊患者和住院患者G6PD标本4625例,2～80C保存,逢周二、周五进行检测。

1.1.1.1.122011年1月至2011年11月本院新生儿足跟采血于滤纸片，送广东省妇幼保健院用荧光斑点做G6PD筛查。从回报结果中，随机抽取51例G6PD缺乏男婴抽静脉血复查G6PD。

1.1.2仪器：奥林巴斯Au5400全自动生化分析仪，

1.1.3试剂

1.1.3.1速率法试剂：北京利德曼生化股份有限公司生产的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶测定试剂盒.

1.1.3.2高铁血红蛋白还原实验试剂美兰试剂(200μl氯化亚甲蓝溶液+200μl亚硝酸钠葡萄糖溶液+3.6ml蒸馏水)

1.2方法

1.2.1全自动生化分析仪速率法

1.2.1.1原理

葡萄糖6磷酸+NADPG6PD6磷酸葡萄糖醛酸+NADPHG6PD在NADP存在条件下催化葡萄糖6磷酸生成6磷酸葡萄糖醛酸和NADPH,在340nm处测定NADPH的生成速率,即可测定葡萄糖6磷酸脱氢酶的活性。计算方法：

溶血液G6PD活性（U/L）=△A/min×Vt×1000／e×Vs×d

=△A/min×F1*

压积红细胞中G6PD活性（U/L）=溶血液G6PD活性×51=F2*×△A/min

F2*=F1*×51=204970

1.2.1.2操作步骤取肝素钠抗凝全血,3000rpm/min,离心5分钟,去掉上清,吸取下层压积红细胞20μl加入1ml去离子水(稀释51倍),充分混匀,待红细胞完全溶解后(约15-30分钟)测定。

1.2.1.3参考值：采用肝素钠抗凝的压积红细胞中成人G6PD的正常参考范围是大于1100U/L，含量在500-1100U/L的样本，为可疑标本，建议做进一步检查.

1.2.2高铁血红蛋白还原实验本室根据Brewer法改良.

2结果

2.1G6PD缺乏患者的G6PD活性范围：51例荧光斑点法测定G6PD为阳性且临床诊断为G6PD缺乏的男婴，使用速率法检测G6PD活性,定量结果为364±196U/L，最高值为569.8U/L，由此将本实验室G6PD缺乏的范围初步定为<600U/L。

2.2G6PD阳性率：4625例标本中，经速率法检测阳性结果311例，阳性率6.72%。

2.3用速率法与美蓝法对640例随机抗凝血标本进行检测,严格按照操作规程和试剂盒说明书进行操作,测得结果见表1。

美兰法阳性率为：76&pide;640=11.8%，速率法阳性率为：38&pide;640=5.9%

两种方法经χ2检验,有显著的差异(P＜0.01)。

3讨论

目前已证明,红细胞G6PD缺乏是引起蚕豆病、伯氨喹啉类药物性溶血、新生儿高胆红素血症、某些感染性疾病所致的溶血和非球形红细胞溶血性贫血的遗传基础[6]。G6PD缺乏是一种常见的遗传性溶血性疾病,呈X染色体连锁的不完全显性遗传,属于出生缺陷的病种.广东地区属于G6PD缺乏症的高发区,G6PD缺乏也是广东新生儿病理性高胆红素血症的最常见病因之一[2]。由于是X连锁的遗传病，因此，临床上男性G6PD的缺乏率大于女性缺乏率；而女性只有一个X染色体有缺陷（杂合子）的机会较大，常常表现为低下。

用荧光斑点做G6PD检测为缺乏的男婴抽静脉血再次检测G6PD活性，从而初步得到速率法检测G6PD缺乏患者的参考值。试剂说明书G6PD缺乏的参考值为<500U/L,根据本实验结果，将我室的活性范围初定为<600U/L。

本次研究速率法检测G6PD阳性率为6.72%，说明我区为G6PD缺乏症的高发地区之一。本次实验结果高于2007年樊瑜等人对相同地区采用G6PD/6PGD比值法研究得到的总阳性率4.41%的结果[5]。除考虑初筛方法之间的差异外，还应考虑到标本来源中我们包括了发生溶血的新生儿黄疸病例及血液病人病例，还有51例为荧光斑点法初筛为阳性的复查病例。去除复查的51例，速率法的阳性率为（311-51）&pide;4625=5.62%，则与樊瑜等的实验结果较为接近。

在本次美兰法与速率法的比较中，美兰法阳性率为11.8%，速率法阳性率为5.9%，差异较大。部分阳性标本的患儿存在新生儿黄疸。

在本次实验过程中，我们发现对速率法检测G6PD的实验结果会产生影响的因素如下：（1）在速率法测定G6PD时偶尔会发现负值或非常低值（<100U/L）的结果，重新检测数值正常；追踪此部分标本发现在溶血过程中出现气泡，自动化仪器探测到气泡面开始检测，结果会造成异常结果；（2）溶血后放置时间过长也会造成G6PD活性降低，1小时后可降低30%（见试剂说明书）。（3）由于压积红细胞较为粘稠，若吸取压积红细胞时移液管的吸放速度太快，会导致吸取血量不准确，因而对结果的影响较大，因此在吸样时要十分注意。建议对于阳性的标本要重新制备溶血液进行复查，以排除假阳性。

在全自动生化分析仪上用速率法检测G6PD活性是近几年受到广泛推广的项目，它的优点是操作简单，批量上机自动加样，减少人为误差。缺点是特异性受限，适合用于筛查实验，溶血标本中G6PD活性丧失很快，吸取压积红细胞量的准确与否等因素对结果的影响较大。速率法在G6PD缺乏症的筛查中，可以检测出大部分的阳性结果，如遇可疑标本，应进行复查或应用决定性方法确诊，如G6PD/6PGD比值法;低温保存标本，避免标本溶血，减少不必要的G6PD活性损失;检测结果若超过检测线性范围，可将标本用生理盐水稀释，测定结果乘稀释倍数。建议在用速率法检测G6PD活性的同时，对抗凝血标本进行血红蛋白含量的测定，计算出每克血红蛋白中G6PD的活性，提高G6PD活性检测的准确率。

参考文献

[1]SimkinsRA,CulpKM.ASimple,rapidfluorometricassayforthedeterminationofglucose6-phosphatedehyogenaseactivityindriedbloodspotspecimens[J].SoutheatAsianJTropMedPublicHealth,1999,30(2):84-86.

[2]陈方平主编.临床检验血液学[M].(第一版)北京:高等教育出版社,2006:128.

[3]许延康等.对红细胞葡萄糖6-磷酸脱氢酶活性测定的几种筛选方法的评价[J].中华医学检验杂志,1980(3):217.

[4]丛玉隆.贫血、血栓及遗传学检验技术与临床[M].天津:天津科学技术出版社,2002:65.

[5]樊瑜等.广州地区2400例孕妇夫妇G6PD缺乏症筛查分析[J].中国热带医学杂志,2007,7(10):1847.

[6]杜传书.我国葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症研究40年的回顾和展望.中华血液杂志,2000,21(4):174.