HPLC法测定依酚氯铵的有关物质

HPLC法测定依酚氯铵的有关物质

陶明锋谭南奇李秋婵田亮谢春燕岳峰

广东嘉博制药有限公司广东清远511517

摘要：建立了测定依酚氯铵中有关物质的高效液相色谱（HPLC）法。采用苯乙烯-二乙烯苯共聚物为填充剂（250mm×4.6mm，8μm），以7.7g/L四甲基溴化铵溶液（用磷酸调节pH=3.0）-乙腈（85：15）为流动相；流速1mL·min－1；柱温30℃；检测波长281nm，依酚氯铵峰与有关物质峰分离完全，有关物质3-二甲氨基苯酚（杂质A）在0.05～2μg·mL-1浓度范围内呈良好的线性关系（r=0.999），回收率为98.7％。方法操作简便，结果准确可靠，可作为依酚氯铵的有关物质测定方法。

关键词：依酚氯铵；3-二甲氨基苯酚；高效液相色谱法；有关物质

DeterminationofRelatedSubstancesinEdrophoniumChloridebyHPLC

TAOMingfeng，TanNanqi，LiQiuchan，TianLiang，XieChunyan，YueFeng

（GuangdongJiaboPharmaceuticalCo．，Ltd．，Qingyuan，Guangdong511517，China）

ABSTRACT：ToestablishanHPLCmethodforthedeterminationofrelatedsubstancesinedrophoniumchloride.HPLCwascarriedoutonStyrene-pinylbenzenecopolymer（250mm×4.6mm，8μm），withthemobilephaseof7.7g/Ltetramethylammoniumbromidesolution（adjustedtopH3.0withphosphoricacid）-acetonitrile（85：15）asthemobilephase.Theflowratewas1mL·min－1，andthecolumntemperaturewassetat30℃withthedetectionwavelengthof281nm.Therelatedsubstancescouldbeeffectivelydetectedandseparatedwithedrophoniumchloridecompletely.Itwaslinearfortherelatedsubstancedimethylaminophenolintheconcentrationrangeof0.05～2μg·mL-1.Itsrecoverywas98.7％.Themethodissimple，reliableandsuitableforthedeterminationofrelatedsubstancesinedrophoniumchloridebyHPLC.

KEYWORDS：edrophoniumchloride；dimethylaminophenol；HPLC；relatedsubstance；determination

依酚氯铵为拟胆碱药物，作为神经肌肉阻滞剂的拮抗剂，对胆碱酯酶有拮抗作用。基本作用与新斯的明相似，但作用较弱，作用快而短暂，仅维持数分钟。原料药及其注射剂已载人美国、英国、日本等国家药典[1][2]。杂质A是依酚氯铵原料药的已知杂质，是合成依酚氯铵的中间体，规定了其限度不得超过0.1％[3]。本文参考有关文献[4]，区别于依酚氯铵注射液的有关物质检测方法，为了提高依酚氯铵原料药有关物质的准确性和检测灵敏度，保证药品质量和用药安全，结合设备情况，建立了对依酚氯铵原料药的有关物质进行HPLC检测的方法。结果显示，本方法系统适应性强，专属性好，误差小，灵敏度高。

1仪器与试药

1.1仪器

高效液相色谱仪（LC-20A），岛津；电子天平（BT125D），日本岛津。

1.2试药

对照品（批号：20-XJZ-65-1，纯度：99%），TRC；依酚氯铵（批号：D030-Z2018001、D030-Z2018002、D030-Z2018003），广东嘉博制药有限公司）；乙腈（色谱纯），SINENCE；四甲基溴化铵，分析纯，阿拉丁；水为纯化水；其他试剂均为分析纯。

2方法与结果

2．1色谱条件

色谱柱：PLRP-S（250mm×4.6mm，8μm）；流动相：乙腈-四甲基溴化铵溶液=15：85（V/V）；流速：1mL·min－1；柱温：30℃；检测波长：281nm；进样量：20μL。

2．2溶液的制备

2．2．1供试品溶液：取本品适量，精密称定，加水溶解并稀释制成每1ml中约含依酚氯铵1.0mg的溶液，作为供试品溶液。

2．2．2杂质A溶液：精密称取3-二甲氨基苯酚适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中约含3-二甲氨基苯酚1.0mg的溶液，作为杂质A溶液。

2．2．3对照溶液：精密量取供试品溶液、杂质A溶液各1ml按1：1的比例混合，用水定量稀释至100ml，取该溶液10ml用水稀释至100ml，作为对照溶液。

2.3系统适用性试验

2.3.1取杂质A对照品适量，加乙腈配制成浓度约为10μg/ml的杂质A对照溶液；取上述杂质A对照溶液适量、依酚氯铵（批号：D030-Z2018001）适量，加水稀释制成杂质A浓度约为1μg/ml、依酚氯铵浓度约为1mg/ml的混合溶液。取上述混合溶液，进样，记录色谱图。结果显示，各杂质峰面积RSD均小于5.0%，保留时间RSD均不大于1.0%。

2．4专属性试验

2．4．1空白干扰：分别取纯化水、乙腈、对照溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，空白溶剂对各杂质测定应无干扰。见图1。

图1各溶液的HPLC色谱图

2．5检测限及定量限

取依酚氯铵适量，配制成适宜浓度的溶液，信噪比约为3时为检测限，进样3针，峰面积的RSD值为0。依酚氯铵适量，配制成适宜浓度的溶液，信噪比约为10时为定量限，平行制备6份定量限浓度的溶液，进样测定，峰面积的RSD值为4.5%。

2．6线性关系考察

取杂质A对照品适量，精密称定，配制浓度为0.05、0.5、1、1.5和2μg·mL-1的依酚氯铵溶液，进样。以浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线。线性方程：Y=0.179X-0.001，r=0.999。杂质A在0.05～2μg·mL-1浓度范围内，与峰面积呈良好的线性关系。见表1。

表1线性关系考察结果

2．7精密度试验

取同批供试品（批号：D030-Z2018001），平行制备6份供试品溶液进行测定，计算各杂质含量的RSD，杂质A均未检出，未知杂质1和未知杂质2含量的RSD分别为2.7%、4.1%。方法重复性良好。由另一分析人员在重复性测定的不同日期平行制备6份供试品溶液，使用另一仪器进样，杂质A均未检出，未知杂质1和未知杂质2含量的RSD分别为2.7%、4.2%。12份供试品溶液的杂质A均未检出，方法精密度良好。见表2。

表2精密度试验结果

2．8准确度试验

表3准确度试验结果

取杂质A对照品适量，精密称定，加乙腈溶解制成浓度约为10μg/ml的杂质A对照品溶液。取依酚氯铵（D030-Z2018001）约20mg，精密称定，置20ml量瓶中，平行9份。分别精密量取上述杂质A对照品溶液1.6ml、2.0ml及2.4ml置已称取依酚氯铵的同一量瓶中，制成三种不同浓度的样品加标溶液，每个浓度平行3份，测定样品加标溶液的杂质A含量。9份溶液回收率在93.9%～102.5%之间，平均回收率为98.7%，RSD为3.2%，说明方法准确度良好。见表3。

2．9稳定性与耐用性试验

2．9．1稳定性：供试品溶液室温放置0h、4h、8h、12h、24h、48h，于各时间点测定杂质含量。各时间点杂质A含量RSD为0.02%，供试品溶液在室温条件下放置48h，稳定性良好。

2．9．2耐用性：在流动相pH变化±0.2、流动相比例变化±5%、柱温变化±5℃，波长变化±5nm，流速变化±0.2ml/min的条件下，测定杂质含量，杂质A含量RSD小于2.0%，方法耐用性良好。

2．10样品测定结果

采用建立的方法，对自制的3批样品的对照品溶液和供试品溶液进行了检测。结果见表4。在供试品溶液色谱图中按外标法计算依酚氯铵中有关物质杂质A的含量，按自身对照法计算依酚氯铵中其他未知有关物质的含量，试验结果表明，以上所有样品均符合要求。见图2和表4。

图2各样品的HPLC色图谱

表4多批样品测定结果

3讨论

杂质A作为合成依酚氯铵的中间体，结构含有基因毒性杂质标示的警示结构，对人体有一定潜在的危害。笔者建立了HPLC法测定依酚氯铵原料药中杂质A的方法，同时对其他未知有关物质进行定量测定。操作快捷简便，精密度、重复性、稳定性良好，结果准确可靠，可作为依酚氯铵原料药有关物质的检查方法。

参考文献：

[1]王兰明.拟胆碱药物依酚氯铵的合成[J].化工时刊，1998，12（12）：29-30.

[2]丁岩冰，孙文娟.依酚氯铵的合成[J].中国医药工业杂志，1994，25（12）：538-539.

[3]USP40，Edrophonium3941.

[4]马玉贞.依酚氯铵注射液中有关物质的HPLC法测定[J].中国医药工业杂志，2014，45（9）：871-873.