淋巴管标记物Podoplanin、D2-40在鼻咽癌组织中的表达及临床意义

淋巴管标记物Podoplanin、D2-40在鼻咽癌组织中的表达及临床意义

江河1兰桂萍1翁敬锦1司勇锋1丁志敏2韦海明2

江河1兰桂萍1翁敬锦1司勇锋1（通讯作者）丁志敏2韦海明2

（1广西壮族自治区人民医院耳鼻咽喉头颈肿瘤科广西南宁530021)

(2广西壮族自治区人民医院病理科广西南宁530021）

【摘要】目的检测两种新的淋巴管特异标记物Podoplanin、D2-40在鼻咽癌组织中的表达，探讨它们在鼻咽癌中的临床病理意义。方法63例确诊中晚期鼻咽癌的患者随机分为2组。治疗组（32例）：rAd-p53瘤内注射+同步放化疗。对照组（31例）：同步放化疗组。分别收集临床资料及rAd-p53瘤内注射前后鼻咽部瘤体活组织标本。采用免疫组化二步法检测鼻咽癌原发灶组织中淋巴管标记物Podoplanin、D2-40的表达情况。结果治疗组中Podoplanin、D2-40淋巴管计数均较治疗前明显下降,差异有统计学意义(P＜0.05)，而对照组中Podoplanin、D2-40淋巴管计数较治疗稍有下降，甚至上升,差异无统计学意义(P＞0.05)。结论Podoplanin、D2-40可能与远处转移有关,接受rAd-p53瘤内注射的鼻咽癌患者Podoplanin、D2-40蛋白表达降低,MLVD数量下降,进而降低远处转移风险。

【关键词】鼻咽癌rAd-p53淋巴管特异标记物

【中图分类号】R730【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）32-0061-02

鼻咽癌是我国南方常见的头颈部恶性肿瘤之一。放射治疗是鼻咽癌的主要治疗手段，治疗失败的主要原因是局部复发和远处转移。rAd-p53是通过腺病毒载体将野生型p53基因转导入肿瘤细胞发挥治疗效应，已成为一种有效的基因治疗途径。我们通过免疫组化检测方法了解rAd-p53瘤内注射前后Podoplanin、D2-40蛋白的表达情况，为rAd-p53治疗提供理论依据。

1材料与方法

1.1临床资料

本组63名病例源于广西壮族自治区人民医院耳鼻咽喉头颈肿瘤科在2007年01月～2010年06月收治的部分鼻咽癌患者，全部病例经病理诊断为未分化非角化性癌，并按研究病例的纳入条件、排除条件入组。入组病例按随机分为2组，治疗组：rAd-p53瘤内注射+同步放化疗，对照组：同步放化疗。

1.2病例选择方法

经病理诊断为鼻咽癌，未行抗癌治疗；全部病例均行鼻咽颅底CT（或MRI）、B超、X线及鼻内窥镜检查了解病变范围；按UICC（1997）鼻咽癌分期方案分期的Ⅲ、Ⅳ期鼻咽癌患者；年龄在20-60岁之间；卡氏评分≥70分；签署知情同意书。

1.3治疗方法

1.3.1放射治疗

采用西门子Primus全数字化直线加速器常规体外照射，采用面颈联合野照射36Gy后缩野，采用耳前野辅以鼻前野，原发灶70-76Gy/35f/7-8w，颈转移灶60-70Gy。

1.3.2化学药物治疗

卡铂+5-Fu方案。剂量按体表面积计算，卡铂500mg（m2?d）-1，d1静脉点滴，5-Fu500mg（m2?d）-1，d1-5，24小时微泵持续输入，同时应用昂丹司琼注射液止吐治疗，与放疗同步进行，28天后重复化疗1次，共2个周期。

1.3.3rAd-p53瘤内注射

重组人p53腺病毒注射液（rAd-p53,中国深圳赛百诺公司生产）剂量：1×1012VP/支，1次/周，治疗6周；用法：用生理盐水稀释rAd-p53到2ml后使用，在鼻内镜直视下多点注入鼻咽部原发灶内；用药时间：于放疗前48-72小时行瘤内注射。

1.4鼻咽癌原发灶标本获取方法

分别于治疗前及放疗20Gy或鼻咽部瘤体组织即将消退前获取活体组织标本。用1％麻黄素液和1％的卡因液棉片行鼻腔、鼻咽部粘膜麻醉，在鼻内窥镜直视下于鼻咽部瘤体处应用活检钳获取活体组织标本。

1.5试剂

免疫组化ElivisionTMplus二步法试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司，DAB显色试剂盒、鼠抗人Podoplanin、D2-40单克隆抗体均购于北京中杉生物技术公司。

1.6免疫组织化学检测

全部标本经4%甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋，切片（4μm），HE染色，光镜检查。采用ElivisionTMplus二步法，根据试剂说明书操作进行Podoplanin、D2-40蛋白检测。

1.7图像分析及结果判定

Podoplanin、D2-40阳性表达于淋巴管内皮细胞胞膜和胞质，呈棕黄色颗粒。微淋巴管计数（MLVD）方法采用Weidner法计数：先在低倍镜下寻找新生脉管最密集的区域即热点（hotspot），然后在高倍镜下对淋巴管进行计数，在肿瘤组织内以5个高倍镜视野脉管的平均数表示微淋巴管（MLVD）。

1.8随访

随访时间是2007年06月至2010年10月，随访方式是患者定期回院复查和专职随访员电话随访。

1.9统计学分析

计数资料采用均数±标准差表示，所有分析均使用SPSS13.0统计学软件进行统计学处理，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1一般资料

按照病例纳入条件和排除条件入组病例63例，男52例，女11例，年龄在22～63岁之间。按UICC（1997）鼻咽癌分期方案分期：Ⅲ期37例，Ⅳ期26例。治疗组入选病例32例，对照组入选病例31例。治疗前两组原发肿瘤大小、年龄、性别、临床分期、T分期、N分期间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1两组患者的一般情况

2.2Podoplanin及D2-40在鼻咽癌组织中的表达

Podoplanin及D2-40蛋白的阳性表达见于所有肿瘤组织，分布在肿瘤实质和外周，呈一致性的管腔结构，有一层薄壁，管腔内很少有淋巴细胞，无红细胞，肿瘤周边淋巴管腔比实质内大，而且数量多。

2.3两组治疗前后Podoplanin蛋白的表达情况

治疗组Podoplanin蛋白表达较治疗前明显降低，差异有显著性意义（P＜0.05）。而对照组Podoplanin蛋白表达较治疗前降低不明显，差异无显著性意义（P＞0.05）。见表2。

表2两组患者治疗前和治疗后鼻咽癌原发灶podoplanin蛋白的表达情况

2.4两组治疗前后D2-40蛋白的表达情况

治疗组D2-40蛋白表达较治疗前明显降低，差异有显著性意义（P＜0.05）。而对照组D2-40蛋白表达较治疗前降低不明显，差异无显著性意义（P＞0.05）。见表3。

表3两组患者治疗前和治疗后鼻咽癌原发灶D2-40蛋白的表达情况

3讨论

p53基因是正常细胞内关键的看家基因，是最重要的一个抑癌基因。其通过以下作用实现抑癌作用：①细胞周期阻滞、促进损伤细胞修复；②诱导严重受损细胞凋亡；③调节机体免疫反应；④抑制生存增殖信号途径；⑤抑制血管生成及物质能量代谢；⑥抑制细胞—细胞黏附及其浸润转移。研究表明：50%以上人类肿瘤存在p53抑癌基因的突变或缺失，而且p53突变与肿瘤细胞对常规化疗药物及放射治疗敏感性下降有关。实验已证实，将野生型p53基因导入肿瘤细胞，可以控制细胞周期和诱导细胞凋亡、增加肿瘤对化/放疗的敏感性，还可通过旁观者效应达到杀灭肿瘤细胞的目的。大量基础和临床前研究结果为p53治疗应用于肿瘤临床提供了充分的依据和坚实的基础。rAd-p53是将野生型p53基因插入缺陷型腺病毒构建而成的国家I类新药。

微血管和淋巴管系统一直被认为在恶性肿瘤侵袭和转移过程中扮演着重要的角色。前些年，微血管生成的研究成为众多学者的研究热点。近年来，随着系列淋巴管特异性标志物，如肾小球足突细胞膜粘蛋白(Podoplanin)、D2—40、血管内皮生长因子受体—3(VEGFR—3)、淋巴管内皮透明质酸酶受体—1(LYVE—1)和Prox-1等的发现，对肿瘤新生淋巴管的研究逐步深入，这使得肿瘤淋巴管生成与肿瘤转移和预后的关系研究成为继肿瘤血管生成之后新的研究热点。

podoplanin是一种相对分子质量为38×103的I型跨膜糖蛋白，由162个氨基酸构成，有1个单一高度保守的跨膜区域，胞内域有9个氨基酸构成，细胞质内的c端有2个潜在的磷酸化位点，胞外域随物种不同而变异较大，但都有相对保守的6个潜在的氧连接型糖基化位点，唾液酸通过α-2，3连接在半乳糖上，构成该蛋白的糖类主要部分。podoplanin在人体多种组织细胞中表达，如在肾足突细胞、骨骼肌、胎盘、肺和心脏、乳腺的肌成纤维细胞、唾液腺、成骨细胞和间皮细胞上，也在鼠肺泡I型上皮细胞膜上表达，偶尔在人表皮细胞的基底层上也能见到局部表达[7-8]，但主要表达在淋巴管内皮上，是淋巴内皮细胞的特异性标志物。我们通过免疫组化检测发现rAd-p53瘤内注射后鼻咽癌原发灶组织中podoplanin蛋白表达较治疗前明显降低，差异有显著性意义（P＜0.05）。而对照组podoplanin蛋白表达较治疗前降低不明显，反而有轻微的增高，差异无显著性意义（P＞0.05）。

单克隆抗体D2-40是新近发现的淋巴管内皮细胞标记物，它是一种相对分子质量为40000的唾液酸糖蛋白，大量研究表明D2舶特异的表达于正常和肿瘤组织的淋巴管，而不表达于伴随的小血管，是目前最好的淋巴管内皮细胞标记物。我们通过免疫组化检测发现rAd-p53瘤内注射后鼻咽癌原发灶组织中D2-40蛋白表达较治疗前明显降低，差异有显著性意义（P＜0.05）。而对照组D2-40蛋白表达较治疗前降低不明显，反而有轻微的增高，差异无显著性意义（P＞0.05）。

综上所述，Podoplanin、D2-40可能与远处转移有关,接受rAd-p53瘤内注射的鼻咽癌患者Podoplanin、D2-40蛋白表达降低,MLVD数量下降,进而降低远处转移风险。所以我们有理由相信，rAd-p53可能通过某种机制抑制鼻咽癌组织内淋巴管生成，从而抑制鼻咽癌的淋巴道转移途径，这正验证了p53基因能够抑制细胞—细胞黏附及其浸润转移的抑癌机制。

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基金项目：广西壮族自治区卫生厅自筹经费计划课题（合同号：Z2008043）

基金项目：广西壮族自治区卫生厅重点项目（编号：重200721）