标本溶血对ELISA检测乙肝表面抗原的影响

标本溶血对ELISA检测乙肝表面抗原的影响

何孝敏陈妍

何孝敏陈妍(河南省郑州市第二人民医院检验科河南郑州450006)

【摘要】目的分析溶血标本采用ELISA法检测HBsAg时对结果的影响。方法选取HbsAg阳性和HbsAg阴性标本各50例，采用冰冻法使这100例标本溶血。溶血标本采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HBsAg，酶标仪判读结果。结果HbsAg阴性溶血标本检测HbsAg的假阳性率为30%，而HbsAg阳性溶血标本检测HbsAg的假阴性率为8%。结论溶血标本采用ELISA法检测HbsAg时容易产生假阴性或假阳性。

【关键词】溶血ELISA法HBsAg

临床检测中常遇到溶血标本,溶血是临床生化检验中最常见的一种干扰和影响因素。标本溶血对酶联免疫吸附试验（ELISA法）检测乙肝表面抗原（HbsAg）的影响较大，各文献报道均有差异，本文就溶血对HbsAg检测的影响进行简要分析。

1材料与方法

1.1试剂与仪器乙肝五项定性试剂为山东潍坊三维生物工程集团有限公司生产的诊断试剂盒,试剂按要求储存并在有效期内使用。方法和结果的判读按试剂盒说明书操作,仪器为Biocell-ht2酶标仪和Biocell-Awl洗板机（澳地利生产）,振荡器。严格按操做规程使用仪器。

1.2标本选取2011年10月来我院检测乙肝病毒血清标志物患者作为检测对象。分别吸取HBsAg阳性（50例）和HBsAg阴性（50例）标本3ml全血，年龄为17～72岁，平均年龄（37±15）岁，男性48例，女性52例。采用冰冻法使这100例标本溶血。

1.3方法

1.3.1溶血血清的制备将待测全血标本放置冰箱（-40摄氏度）20分钟后，取出室温融化，再以3000r/min离心，分离血清1.5ml备用。

1.3.2ELISA法检测HBsAg严格按照第三版《全国临床检验操作规程》[1]检测。

2结果

表1100例溶血标本检测HBsAg结果

3讨论

溶血可分为体外溶血和体内溶血，体外溶血多为物理因素（抽血时负压过大、水浴温度过高、冰冻、振荡等机械性破坏）、化学因素（血样接触表面活性剂）和代谢因素（如遗传病引起红细胞脆性增加）引起。体内溶血多为药物，化学，自身代谢等多种因素引起。临床标本溶血的主要原因包括:由于病人严重脱水、低血容量休克等原因导致穿刺困难造成的溶血;由于抽血器具质量不合格如真空管负压不够或塑料试管质量较差导致的溶血;用干燥管采血为了尽快分离血清用竹签搅拌不当引起的溶血等。溶血时除常见的红细胞破坏外,血小板、白细胞等血细胞破坏释放的某些胞内成分也可干扰或影响临床检验结果的判定。

ELISA法是目前国内最常用的乙肝五项检测方法，该方法灵敏度可达ng/ml水平［2］。其操作过程中有许多影响因素,其中血清的分离、反应温度、时间及洗板是关键。本实验中HBsAg阴性溶血标本检测HBsAg的阳性率为30%，而HbsAg阳性溶血标本检测HBsAg的阴性率为8%。低于孙艳霞[3]相对应41.7%和11.7%的报道，这表明溶血标本采用ELISA法检测HbsAg时容易产生假阴性或假阳性。其主要原因是反应孔对溶血血清中血红蛋白（Hb）的非特异性吸附和溶血时细胞内液对血清的稀释作用。

溶血引起假阳性的主要原因是:溶血时红细胞破坏，胞内Hb进入血清，Hb具有类过氧化物酶活性，其作用与辣根过氧化物酶类似，如果反应孔非特异吸附Hb而残留，则可催化底物显色，使本底OD值升高甚至造成假阳性。据方晔[4]报道，溶血可显著升高HBsAg的OD值，可造成假阳性检测结果。溶血标本中的Hb有类似过氧化物酶的活性,在温育过程中吸附于固相,难于完全洗脱,可催化底物显色而产生假阳性[5]。

溶血引起假阴性的主要原因是“钩状效应”，如标本中HBsAg浓度过高，则因竞争抑制作用，难以形成“夹心复合物”，出现显色变浅甚至不显色的现象，称为Hook现象，导致HBsAg的漏检。ELISA试验中酶标反应板孔包被物的浓度是一个相对定值，抗原抗体反应存在最适比例和后带现象，HBsAg浓度与OD值只是在一定的范围内呈一定的线性关系;当HBsAg达到一定浓度时OD值的变化进入平台期;当HBsAg浓度太高时，OD值反而会降低。因此，溶血可以使HBsAg浓度很高的样品的OD值升高（在一定程度上解决了后带现象）;当HBsAg浓度与OD值呈线性关系时才会因溶血的稀释作用使OD值下降;当HBsAg浓度近临界值时，可能造成假阴性[6]。

因此，标本溶血不宜用ELISA法检测HBsAg。影响的性质及其大小因所使用的试剂、测定方法、标本HBsAg的有无及浓度高低、洗板的质量好坏而异。如果洗涤质量好，则可能大大减少或排除非特异性吸附的干扰。某些特殊原因溶血标本（如体内溶血），无法重新采血时，建议采用二步法操作，很大程度降低过氧化物酶残留的可能性，排除溶血释出的Hb对HBsAg检测的影响，减少假阳性的发生。

综上所述，为减少ELISA法检测HBsAg时的误差，在标本的采集、运送、分离和检测过程中应尽量避免人为原因造成的溶血。因此要求临床医护人员重视规范性抽血，防止产生溶血标本[7]。严格按试剂盒说明书操作，做好阴、阳性及临界值对照。结果判读应使用酶标仪，以减少人为误差。需切实加强实验室质控工作，保证检测结果的准确性,并对检测过程进行严格的标准化[8]。

参考文献

[1]叶应妩,王毓三,申子瑜.全国临床检验操作规程[M].南京:东南大学出版社,2006.737-753.

[2]王健，闵福援．乙肝病毒血清标志物的检测方法及其临床意义[J]．中华检验医学杂志，2005，28(1)：113－115．

[3]孙艳霞.简要分析标本溶血对ELISA检测血清乙肝表面抗原的影响[J].标记免疫分析与临床,2009,16(4):253-254.

[4]方晔.标本久置及溶血对ELISA方法检测HBsAg的影响[J].江西医学检验，2003，21（5）：405.

[5]黄秋芳,王微,李永.ELISA检测HBsAg复检结果的分析[J].检验医学，2004;19(4):603.

[6]李玉华，罗万胜.溶血对ELISA检测乙肝表面抗原的影响的探讨.中医临床研究,2010,2(21):61.

[7]苗青兰.标本溶血对常规生化检验项目的影响[J].医学信息，2011,24（2）：996-997.

[8]陈妍.郑州地区普通人群与大学生乙型肝炎5项检测分析[J].国际检验医学杂志，2008,29（8）：751-752.