SELDI-TOF-MS在口腔鳞癌早期诊断中的研究

SELDI-TOF-MS在口腔鳞癌早期诊断中的研究

刘建林郑春兰

刘建林郑春兰（深圳市福田区中医院口腔科518000）

【摘要】目的：为鉴定口腔鳞癌的血清标志物和病理分型提供依据。方法：采用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术及其配套的金芯片(GoldChip)对30份腺癌及健康人30份计60份血清，进行蛋白质谱指纹图分析，筛选口腔鳞癌的差异蛋白。结果：在口腔鳞癌患者血清中有3个高表达，m／z(质荷比)分别是9194．06Da，11681．15Da和51370．19Da，应用数据建立分类树模型，获得了一个由7个蛋白9194．06Da，51370．1Da，15879、1Da，6624．57Da，8929．80Da，1l681．1Da，1013．77Da组成的标志蛋白组合模式。在训练组中，该模型的敏感性和特异性分别为92％和96％。结论：该模型对诊断口腔鳞癌具有较高的灵敏度和特异度，值得临床应用。

【关键词】口腔鳞癌；蛋白质质谱；诊断【中图分类号】R2【文献标号】A【文章编号】1671-8725（2014）10-0157-02

目前，在我国口腔颌面部肿瘤中，死亡率最高的口腔鳞癌仍居榜首，口腔鳞癌发病率高、预后差的现状仍无根本性改观。因此口腔鳞癌患者的筛查和早期诊断对口腔鳞癌的疗效显得尤为重要。本研究拟应用表面加强激光解吸电离飞行时间质潜技术及其配套的蛋白质芯片对口腔鳞癌患者和正常对照者血清中的蛋白质组图谱进行检测，并结合相关软件建立决策分类树诊断模型，进行口腔鳞癌的初步诊断。

1资料与方法

1.1临床资料与标本来源选择2008年1月1日-2009年12月3113间，在南京大学医学院住院首次治疗的口腔鳞癌患者30例，其中男24例，女6例，年龄为42-78岁，中位年龄62岁，临床病例资料完整，人院第二天晨起抽血，2h内提取血清后即人-80℃保存。对照组选用同期院内职工体检健康者血清标本30例，作为正常对照组，男19例，女11例，年龄为40—83岁，中位年龄60岁。

1.2试剂与仪器l％的乙酸钠、0.9％的氯化钠、l％的N一2一羟乙基哌磺嗪一N一2乙磺酸(HEPES)、l％的1，4一二硫代苏糖醇(DTT)来自上海化学试剂公司；芥子酸(SPA)、乙睛(ACN)、n一氰基一4一羟基肉桂酸(CHCA50mg／m1)、MALDl校正标准肽来自美国SIGMA公司；All—in—oneNP20标准蛋白质芯片、WCX一2芯片来自美国Ciphergen公司。高速台式离心机型号5415功(德国Eppendorf公司)、微量加样器(德国Eppendorf公司)、SELDI质谱仪PBS1IC(美国Ciphergen公司)。

1.3实验方法1.3.1血清标本收集清晨空腹采取全血标本，常温下放置2h，待自然凝固后，4℃1000r／min离心15min，取上层血清EP管分装后立刻置血清标本库一80℃冰箱保存备用。

1.3.2血清样品预处理取出一80％保存血清，0℃冰浴中溶解，4℃10000rpm离心2min，取5斗l血清样品，加入8mmol／L尿素10斗l，4℃振荡30min，吸取上清用于蛋白质芯片检测。

1.3.3SELDI操作流程在CMIO蛋白质芯片8个点(A—H点)的表面分别加10mMHCI10¨l，在湿盒内放置10分钟后，吸去剩余的HCI，用去离子水洗芯片3次。然后将芯片安装于生物处理器上。

芯片A—H各点用200斗l结合缓冲液(100mMNaAc乙酸钠，pH4.0)预处理2次，每次室温下振荡孵育5分钟。然后每点交叉滴加100“l已处理的口腔鳞癌或正常对照血清样品，室温振荡孵育60分钟。弃掉表面样品，各点用200“l结合缓冲液洗涤3次，每次5分钟。最后各点再用lmMHEPES(pH7.0)200¨l迅速洗涤一次。卸去生物处理器，待芯片表面自然晾干后，各点加两次0．5斗lSPA，待芯片表面干燥后，用蛋白质芯片阅读机进行蛋白质谱分析。

1.3.4数据采集采用PBSII—C型蛋白质芯片阅读机读取cM10芯片数据。每天使用前用Ciphergen公司提供的all—in—oneNP20蛋白芯片校正质谱仪，系统质量偏差为0.1％。检测芯片时蛋白质芯片阅读机设置条件如下：激光能量200，检测敏感度9，优化分子量范围1000—70kDa，每个样品收集50个点，采用Ciphergenproteinchip分析软件自动采集数据。

2结果1口腔鳞癌组和正常对照组血清蛋白指纹图谱绝大多数的蛋白质峰数量和强度在口腔鳞癌患者和正常对照者血清中基本相同，P≤0．05时，两组间有9个差异性表达蛋白峰，其中3个在口腔患者血清中高表达，m/z分别是9194．06Da，1l681.15Da和51370.19Da，6个在口腔鳞癌患者血清中低表达，m/z分别是8815.96Da，13767.56Da，13884.95Da，14057.50Da，15879.20Da和17377．2.1口腔鳞癌组和正常对照组血清蛋白指纹图谱绝大多数的蛋白质峰数量和强度在口腔鳞癌患者和正常对照者血清中基本相同，P≤0．05时，两组间有9个差异性表达蛋白峰，其中3个在口腔患者血清中高表达，m/z分别是9194.06Da，1l681.15Da和51370.19Da，6个在口腔鳞癌患者血清中低表达，m/z分别是8815．96Da，13767.56Da，13884.95Da，14057.50Da，15879.20Da和17377.60Da。户≤0.01时有4个显著差异性表达蛋白峰，其中3个在口腔鳞癌患者血清中高表达，m/z分别是994.06Da，1l681.15Da和5l370.19Da，1个在口腔鳞癌患者血清中低表达，m/z是8815．96Da。

2.2口腔鳞癌决策分类树诊断模型的建立将BiomarkerWizard软件分析获得有差别的蛋白质峰建它数据库，导入BiomarkerPattern统计分析软件采用决策聚类树分析法进行分析处理(灵敏度界定于0.05。

3讨论我国，口腔鳞状细胞癌是口腔颌面部最常见的肿瘤，是具有不同程度鳞状分化的上皮性侵袭性的肿瘤，有早期、广泛的淋巴结转移倾向，且主要发生在40-60岁的烟酒嗜好者。主要病理变化是异常增生的上皮细胞突破基底膜向间质侵润性生长。具有形成细胞间桥和不同程度角化的特点[1]。根据肿瘤的恶性程度、细胞和细胞核的多形性以及细胞分裂活动性等将鳞癌状细胞分为高、中、低分化三级：高分化鳞状细胞癌与正常鳞状上皮颇类似，即含有数量不等的基地细胞和具有细胞间桥的鳞状细胞，角化明显，核分裂象少，非典型核分裂和多核细胞极少，胞核和细胞多形性不明显；中度分化的鳞状细胞癌具有独特的核的多形性和核分裂，包括非正常核分裂，角化不常见，细胞间桥不明显；低分化鳞癌以不成熟的细胞为主，有大量的正常或不正常的核分裂，角化非常少，细胞间桥几乎不能发现。因此有必要寻求一种快速有效的早期筛查诊断方法，使疾病在发生的早期就可以发现，并得到控制和治疗，进而提高治愈率，改善患者的预后。分子诊断的进展现已允许在单个试验中评估多个基因或蛋白，这一特点尤其在复杂性状疾病（如肿瘤、心脑血管疾病、代谢病、神经系统疾病、自身免疫性疾病等）的研究中更为明显。在筛选正常细胞和疾病细胞之间个别蛋白的差异表达、确定疾病发生的关键途径以及将疾病分成各种临床类型等方面，蛋白质组学具有振奋人心的潜能[2]。质谱技术是蛋白质组研究中最___________重要的技术，在蛋白质组学研究中应用最广泛的质谱技术是MALDI-TOF质谱，基于MALDI-TOF的液体芯片飞行时间质谱系统用于疾病生物标志物的研究无疑走在分子诊断的前沿，引领分子诊断的发展[3]。液体芯片飞行时间质谱技术的工作流程因研究的目的不同而不同，通常分为两类：①用于蛋白质/肽表达谱检测研究；②用于发现和鉴定生物标志物的临床蛋白质组表达谱研究。用于蛋白质/肽表达谱检测研究的工作流程为：①应用磁珠法（MB）和AnchorChip?技术对血清样品进行质谱检测前的分级分离和制备；②应用基质辅助激光解析电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱技术进行检测，得到线性和反射模式的蛋白质表达谱；③应用MALDI-TOF/TOF质谱技术对同一检测样品斑或重新点样以识别低分子量（MW）质谱峰；④应用ClinProTools软件进行数据的筛选，蛋白质组指纹的生成和可视化。

参考文献[1]成海平,钱小红.蛋白质组研究的技术体系及其进展[J].生物化学与生物物理进展,2000,27(6):584-588.DOI:10.3321/j.issn:1000-3282.2000.06.004.[2]朱金蕾,张锴,何锡文等.基于质谱技术蛋白质定量方法的研究进展[J].分析化学,2010,38(3):434-441.DOI:10.3724/SP.J.1096.2010.00434.[3]陈益定,郑树,余捷凯等.血清蛋白质质谱模型在大肠癌诊断中的应用[J].中华肿瘤杂志,2004,26(7):417-420.DOI:10.3760/j.issn:0253-3766.2004.07.009.