脑神康胶囊对高糖乏氧环境下大鼠海马神经元8-OHdG及相关氧化应激因子表达的影响

脑神康胶囊对高糖乏氧环境下大鼠海马神经元8-OHdG及相关氧化应激因子表达的影响

成伟刘德山（通讯作者）乔云高伟梁尔顺吕忠

成伟刘德山（通讯作者）乔云高伟梁尔顺吕忠宽

（山东大学齐鲁医院中医科山东济南250012）

【摘要】目的：研究高糖乏氧环境下体外培养的大鼠海马神经元8-OHdG、HIF-1α、ROS、p47phox、Nox4因子的表达并探讨脑神康胶囊对神经元的保护作用。方法：实验分为正常对照组、高糖乏氧组、脑神康高、中、低剂量组。Elisa检测8-OHdG、ROS、HIF-1α蛋白浓度，Real-timePCR法检测各组海马神经元HIF-1αmRNA、p47phoxmRNA、Nox4mRNA的表达。结果：与高糖乏氧组比较，脑神康各浓度组8-OHdG、ROS、HIF-1α产生明显降低，HIF-1αmRNA、p47phoxmRNA和Nox4mRNA的表达明显下降，以高剂量组下降最明显(P均﹤0.05)。结论：脑神康可保护高糖乏氧环境下大鼠海马神经元，其机制可能与下调8-OHdG、ROS、HIF-1αmRNA、p47phoxmRNA和Nox4mRNA的表达，减轻氧化应激损伤有关。

【关键词】海马神经元；高糖乏氧；氧化应激；脑神康胶囊

【中图分类号】R285.5【文献标识码】A【文章编号】1004-6194（2015）01-0109-02

EffectsofNaoshenkangcapsuleonexpressionof8-OHdGandotherrelatedfactorsofrathippocampalneuronsinanoxiaandhighglucose

CHENGWei,LIUDe-shan,QIAOYun,GAOWei,LIANGErshun,LVZhongkuan

(DepartmentofTraditionalChineseMedicine,QiluHospitalofShandongUniversity,Jinan250012,Shandong,China)

【Abstract】Objective：TostudyiftheNaoshenkangcapsulecouldinfluenceexpressionof8-OHdG、HIF-1α、ROS、p47phox、Nox4ofrathippocampalneuronsinanoxiaandhighglucose.Methods：Theexperimentalgroupswascarriedoutasfollows:thenormalcontrolgroup,thehighglucoseandx/xogroup;thelarge,middleandsmalldosagesofNaoshenkanggroups.TheproteinsandmRNAexpressionof8-OHdG、ROS、HIF-1αweredetectedbytheElisaKitandRT-PCR.Results：Comparedwiththoseofthex/xogroup,allaboveparametersinalloftheNaoshenkanggroupswerelower(P<0.05).Conclusion：TheNaoshenkangcapsulecanefficientlyreducetheexpressionof8-OHdG、ROS、HIF-1α、p47phox、Nox4mRNA,thenfinallydecreasetheoxidativestressinjury.

【Keywords】Hippocampalneurons;Naoshenkangcapsule;Highglucose;Xanthine/xanthineoxidase;Oxidativestressinjury

糖尿病脑病主要表现为认知功能障碍和大脑的神经生理及结构改变，是高糖长期作用神经系统的结果。研究表明氧化应激在糖尿病大脑损伤中起到重要作用，主要损害海马神经元造成糖尿病认知功能障碍[1]。8-OHdG是DNA氧化应激损伤的重要标志物[2]。本实验研究高糖乏氧环境下大鼠海马神经元8-OHdG、ROS、HIF-1α、p47phox、Nox4因子的表达，探讨脑神康胶囊减少ROS产生，降低DNA氧化损伤的具体作用机制。

1方法

1.1制备含中药血清选择24只成年雄性Wistar大鼠，随机分为正常对照组（0.9%Nacl）、脑神康低(5ml/kg)、中(10ml/kg)、高(20ml/kg)剂量组，等量灌胃给药；每天2次，连续3d，末次给药1h后，无菌条件下右心房取血，离心分离血清，灭活、分装。

1.2制备高糖乏氧损伤模型原代培养海马神经元，细胞培养8天后，分组及处理如下：高糖乏氧组：加入终浓度为1mmol/L的X和20U/L的XO产氧体系，作用45min后换无血清高糖培养基培养，12h后测指标；脑神康低、中、高剂量组则分别将脑神康低、中、高剂量的含药血清加入培养液中作用30min，后加入X/XO体系，作用45min后换无血清高糖培养基培养，12h后测指标；正常对照组：常规换液培养，12h后测指标。

1.3Elisa检测8-OHdG、ROS、HIF-1α按照Elisa检测说明书操作。

1.4Real-TimePCR法检测HIF-1αmRNA、p47phoxmRNA和Nox4mRNA的表达。

1.5统计学处理统计学分析使用SPSS18.0软件，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验和方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组海马神经元形态，见图1。

3讨论

氧化应激的增强和抗氧化防御系统受损在糖尿病并发症的发生和发展中起到重要作用。海马是大脑学习记忆最重要及对氧化应激损伤最敏感的部位。本实验研究证实，脑神康胶囊能够明显保护受高糖乏氧刺激的海马神经元。高糖环境下ROS蓄积可形成DNA氧化损伤产物8-OHdG，使ROS生成增加，形成恶性循环，这是造成2型糖尿病患者胰岛素抵抗及形成其他并发症的重要病理机制，8-OHdG可以作为反映糖尿病患者氧化应激状态较好的指标[3]。本实验研究发现脑神康胶囊可明显降低高糖乏氧条件下8-OHdG的表达，保护受损海马神经元。

HIF-1α是参与氧平衡调节的关键核转录因子，而NADPH氧化酶可调节细胞HIF-1α和ROS水平，并且是细胞内ROS的主要来源[4]。NADPH氧化酶的胞浆亚基之一p47phox在各种因素导致的氧化应激中发挥关键作用[5]，使NADPH酶活化，诱导大量ROS产生，并可导致大量8-OHdG生成，形成恶性循环，最终导致神经元细胞损伤和凋亡。另外NOX4（NADPH氧化酶4）来源的ROS过度蓄积与老年痴呆等神经退行性变的发生密切相关[6]。本实验研究发现：在脑神康胶囊干预下，受高糖乏氧刺激的大鼠海马神经元内HIF-1α、ROS、8-OHdG的产生和HIF-1αmRNA、p47phoxmRNA和Nox4mRNA的表达明显减少，提示脑神康胶囊能有效保护受高糖乏氧刺激的大鼠海马神经元，减轻氧化应激损伤。黄芪、川芎、葛根等是脑神康胶囊的重要组成部分，研究发现黄芪可减少8-OHdG的含量，川芎嗪、葛根素具有抗自由基、抗细胞凋亡作用[7]。故脑神康胶囊可能通过各成份间的协同作用降低血糖、抑制氧化应激反应、改善认知功能障碍，进而发挥防治糖尿病脑病的作用。

参考文献：

[1]daSilvaMH,daRosaEJ,deCarvalhoNR,etal.Acutebraindamageinducedbyacetaminopheninmice:effectofdiphenyldiselenideonoxidativestressandmitochondrialdysfunction[J].NeurotoxRes,2012,21(3):334-344.

[2]EchtayKS,RousselD,St-PierreJ,etal.Superoxideactivatesmitochondrialuncouplingproteins[J].Nature,2002,415(6867):96-99.

[3]周厚地,刘东方.8-OH脱氧鸟苷与糖尿病[J].国际内分泌代谢杂志,2007,27(6):392-394.

[4]RichardDE,BerraE,PouysségurJ.Nonhypoxicpathwaymediatestheinductionofhypoxia-induciblefactor1alphainvascularsmoothmusclecells[J].JBiolChem,2000,275(35):26765-26771.

[5]HordijkPL.RegulationofNADPHoxidases:theroleofRacproteins[J].CircRes,2006,98(4):453-462.

[6]KrauseKH.Aging:ArevisitedtheorybasedonfreeradicalsgeneratedbyNOXfamilyNADPHoxidases[J].ExpGerontol,2007,42(4):256-262.

[7]XieN,WangC,LianY,ZhangH,etal.Puerarinprotectshippocampalneuronsagainstcelldeathinpilocarpine-inducedseizuresthroughantioxidantandanti-apoptoticmechanisms[J].CellMolNeurobiol,2014,34(8):1175-1182.