浅析高效液相色谱法测定氟康唑血药浓度

浅析高效液相色谱法测定氟康唑血药浓度

赵丽华

辽宁丹生生物制药有限公司辽宁丹东118007

摘要：目的：采用高效液相色谱法测定血浆氟康唑血药浓度。方法：采用二氯甲烷萃取，高效液相色谱法检测，以单硝酸异山梨酯为内标，PhenomenxC18色谱柱（4.6mm×250mm，4μm），流动相为乙腈-水-冰醋酸（25∶75∶0.2），流速为1.0ml/min；检测波长为261nm。结果：血浆中内源性物质不干扰氟康唑的检测，氟康唑的线性范围为0.125～8.000μg/ml，批内、批间精密度均小于15%，低、中、高浓度的（0.25μg/ml、1μg/ml和4μg/ml）平均提取回收率分别为100.0%、98.8%、86.7%。结论：这种方法与传统的测定方法相比优势明显，不仅结果准确，且操作简单、快捷，完全可以满足当前人体要学的研究要求。

关键词：高效液相色谱法；血药浓度；测定；氟康唑

氟康唑是治疗真菌感染的一种药物，为广谱抗真菌药，对人和动物的真菌感染均有治疗作用，目前市场上有片剂、胶囊、粉针剂和注射液几种剂型。为氟代三唑类抗真菌药，抗菌谱与酮康唑相似，抗菌活性比酮康唑强。其作用机制是抑制真菌细胞膜必要成分麦角甾醇合成酶，使麦角甾醇合成受阻，破坏真菌细胞壁的完整性，抑制其生长繁殖。血浆蛋白结合率较低，一般为11％～12％，给药剂量的80％以原型药随尿液排除。患者一般对本药能很好地耐受，常见的副作用有恶心、腹痛、腹泻、胃肠胀气、皮疹等，亦可产生肝酶升高。目前，国内已有多家药厂生产。

一、仪器与试剂

1.日本岛津LC-10ATVP高效液相色谱仪HW-2000色谱工作站

2.试剂：磷酸二氢钾（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）、甲醇（色谱纯）、纯化水、氟康唑对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100314-0101，含量100.0%）、氟康唑（民生药业集团绍光医药有限公司）

二、方法与结果

1.色谱条件

色谱柱为迪马公司生产的KromasilC18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相为pH7.0磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钾6.8g，加水适量溶解，加0.1mol/L氢氧化钠溶液约291ml，调节pH至7.0，用水稀释至1000ml，混匀，即得）-甲醇（55：45）为流动相；检测波长260nm；流速为1.0ml/min；超声脱气20min；柱温为室温；进样量20μl。

2.对照品溶液的制备

精密称取氟康唑对照品20.02mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。

3、血浆样品处理方法

精密吸取血浆样品1．0mL置于具塞离心管中，加100uL非那西丁内标溶液（o．25ttg／mL），200uL氢氧化铵溶液（1．5mol／L），乙酸乙酯7．0mL，置于YKH—II型液体快速混合器中混匀30s，离心5min（4000r／min），分离有机相置于55℃水浴上以氮气吹干，残余物以甲醇100ul溶解，取20uL进样分析。

3.线性关系考察

精密称取氟康唑对照品适量，至50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，再分别精密量取适量，用水配制成100、150、200、250、300μg/ml的标准溶液，分别进样20μl。以色谱峰面积为纵坐标（Y），氟康唑含量为横坐标（X），绘制标准曲线，回归方程为Y=1421X+93，r=0.9998（n=5）。结果表明氟康唑在100-300μg/ml范围内呈现良好线性关系。

4.供试品溶液的制备

精密称取氟康唑20.01mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。

5.精密度试验

精密吸取对照品溶液，连续进样5次，记录峰面积的平均值为284296，计算RSD为0.62%。

6.稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液20μl，分别在0、2、4、6、8小时进样测定，记录峰面积平均值为280176，计算RSD为0.65%。表明供试品溶液以流动相为溶剂在8小时内稳定。

7.重复性试验

取同一批样品，精密称取5份，按上述方法制备供试品溶液，依上述色谱条件测定氟康唑含量，结果平均含量为98.73%，其RSD=0.75%。

8.回收率试验

精密称取氟康唑对照品20.01mg，置100ml量瓶中，按供试品溶液的方法制备，按上述色谱条件测定，平均回收率为100.15%，RSD=0.98%。

三、讨论

氟康唑血药浓度检测方法文献提到采用微生物法、气相色谱法[1]，微生物法是利用药效学特征测定药物浓度，虽然便捷、经济，但有一定的局限性，如线性范围窄（需要较多的时间点测定方能确定有效的线性范围）和无法进行良好的全程质控等[2]，现已不主张使用。气相色谱法由于仪器维护、使用较为复杂，在临床药学方面使用频率亦不高。目前氟康唑体内的药物浓度测定也有使用高效液相-质谱联用法（LC/MS）法的，虽定量准确、灵敏、用时少，但仪器、维护费用较昂贵；高效液相色谱法[4-5]以其灵敏、高效、普及得到广泛使用，本文在已有文献的基础上，建立RP-HPLC内标法测定健康受试者血浆中氟康唑浓度的方法，血浆中内源性物质不干扰样品的测定，标准曲线线性范围为0.125～8.000μg/ml，定量下限为0.125μg/ml（S/N>3），低、中、高3个浓度的平均提取回收率为分别为100.0%、98.8%、86.7%；日内和日间RSD均小于15%，每个样品的进样时间约为9.0min。该方法符合生物样品分析要求，且灵敏、操作快速、简单、准确，适用于临床药代动力学研究中大批量生物样品的分析，并可用于临床血药浓度的监测，以便制订合理化给药方案及用于同种药物不同厂家、不同剂型的质量评定。

文献多采用以磷酸盐为流动相的水相、甲醇或乙腈作为洗脱系统，本实验把水相换为冰醋酸水溶液，不用磷酸盐，可减小磷酸盐对色谱柱的损害及降低使用后色谱柱的维护时间。血样处理文献采用固相萃取技术，费用及技术要求均较高；实际操作中使用较多的是对血样先碱化，然后乙酸乙酯萃取，本文也曾试用该法，效果不理想，而采用二氯甲烷液-液萃取，获得了较好的回收率及出峰位置。检测波长曾按文献[5]设为210nm，虽可增加信号的响应值，但血样中杂质对氟康唑及内标的干扰较大。在本试验色谱条件下，内标曾选用非那西丁、别嘌醇、美托洛尔等，但均易与氟康唑峰或干扰峰重叠，后将检测波长调整到261nm，用单硝酸异山梨酯做内标，尽管它们结构不同，保留时间有一定的差别，但无内源性物质的干扰，故选用它作为内标控制实验误差。

四、结论

原产品质量标准中是用非水溶液电位测定法测定含量，为严格控制产品质量，保证药品生产投料含量计算的准确性，建议用HPLC法测定。该方法简便可靠、精密度高、分离效果较好，对于控制氟康唑含量有一定意义。

参考文献：

[1]王威，郑娜，邵龙，等.外排转运蛋白P-糖蛋白、乳腺癌耐药蛋白对氟康唑脑内分布的影响[J].解放军医学院学报，2017，38（7）：671-674.

[2]佚名.HPLC法测定人血浆中的氢氯噻嗪及其在药代动力学研究中的应用[J].西北药学杂志，2018，33（5）：651-654.

[3]陈敖，王建，陈兰萍，等.高效液相色谱法测定艾氟康唑原料药的有关物质[J].广东化工，2018（10）.

[4]佚名.高效液相色谱-串联质谱法测定化妆品中7种抗真菌药物[J].中国卫生检验杂志，2018，v.28（16）：44-47.

[5]姜艳芳.氟康唑与达克宁栓联合用药方案治疗复发性念珠菌性阴道炎的临床评价[J].中国现代药物应用，2018（2）：80-82.