DNA芯片分析乙型肝炎病毒基因多态性简便方法研究

DNA芯片分析乙型肝炎病毒基因多态性简便方法研究

王万相1马达1王惠民2郭乃洲1蒋玲1

王万相1马达1王惠民2郭乃洲1蒋玲1张冬雷2

（1南通大学第四附属医院检验科江苏盐城224006)

(2南通大学第一附属医院检验科江苏南通226002）

【中图分类号】R512.6+2【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2009)25-0073-02

【摘要】目的建立一种简便方法，用于乙型肝炎病毒基因（HBVDNA）多态性分析。方法将标记生物素的dUTP在双重聚合酶链反应（PCR）时掺入DNA样品目的断片，并将目的断片杂交于含HBV核苷酸序列（1896、1814、1762、1764、P区552）的野生型及突变型探针的DNA芯片上，用亲和素-碱性磷酸酶进行显色，并转印于尼龙膜上，再用光学扫描仪读取结果。结果42例乙型肝炎患者HBV核苷酸序列1896、1814、1762、1764、P区552位点突变率分别为40%、31%、50%、50%、10%；该法检测敏感度为5.6×102病毒拷贝数/毫升；特异性高；强、弱阳性批内变异系数（CV）分别为15.1%和19.8%。结论生物素-亲和素系统用于HBVDNA多态性芯片显色，该法简便，不需特殊设备，易于推广应用。

【关键词】DNA芯片生物素-亲和素HBVDNA多态性酶呈色

乙型肝炎病毒基因（HBVDNA）的高度变异性在临床上时常发生，研究HBVDNA序列多态性以及在病因和病毒表达上的作用已成为当今乙型肝炎病毒（HBV）研究的热点。DNA芯片是生物芯片的一种，目前该技术已被成功地用于基因差异性表达的评价、突变检测及遗传多态性研究，其杂交结果的检测方法主要是荧光标记法，利用激光共聚焦荧光扫描仪读取荧光信号，由于设备价格昂贵，使得该技术难以在临床推广应用。我们应用生物素标记dUTP建立生物素-亲和素系统，进行酶呈色并将结果转印于尼龙膜，用于HBVDNA多态性分析芯片信号的呈现，该法简便，不需特殊设备，易于推广应用，现报告如下。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象本院门诊及住院乙型肝炎患者42例；对照组41例（体检正常人群28例，丙型肝炎患者11例，戊型肝炎患者2例，肝炎患者均为单独感染）；细菌2种（纯培养大肠杆菌及金黄色葡萄球菌）。

1.1.2HBVDNA多态性分析芯片根据HBVDNA全序列，优选临床常见突变位点，组合设计多条寡核苷酸探针（长度均在25bp以内），由中国科学院上海微系统与信息技术研究所采用预合成点样制成，主要信息包括HBVDNA前C区1896位、1814位突变，BCP区1762位、1764位突变和P区552位突变。

1.1.3上、下游引物

P区5’-CAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCC-3’

5’-GGCAAAAAGGGACTCAAGATG-3’

前C/C区5’-AGGAGTTGGGGGAGGAGACAT-3’

5’-TCAGAAGGCAAAAAACAGAGT-3’

1.1.4PCR反应液10×PCRBuffer1.5μl，200μmol/LdGTP，200μmol/LdCTP，80μmol/LdTTP，40μmol/L生物素标记dUTP，上、下游引物各0.2μmol/L，1.25UTagPlus加水至13μl。

1.1.5洗液Ⅰ150mmol/L氯化钠，150mmol/L柠檬酸钠，0.1%十二烷基硫酸钠。

1.1.6洗液Ⅱ100mmol/L马来酸，150mmol/LNaCl，0.3%（V/V）Tween20，pH7.5。

1.1.7酶结合物1U/ml亲和素-碱性磷酸酶。

1.1.8平衡液100mmol/LTris-HCL，100mmol/LNaClpH9.5。

1.1.9显色液BCIP/NBTSolution。

1.2方法

1.2.1乙肝病毒基因组DNA提取方法见参考文献[1，2]，主要步骤：100μl血清加裂解液（100mmol/LTris-HCL,pH8.0,5mmol/LEDTA,0.5%SDS,150μg/ml蛋白酶K）300μl，65℃3小时，常规酶/氯仿提取，乙醇沉淀，DNA溶于20μl双蒸馏水中。RNA及细菌DNA抽提见参考文献[3]，RNA均逆转录成cDNA。

1.2.2将上述DNA抽提液及cDNA各2μl分别加入PCR反应液中，混合后，于PCR热循环仪，通过热循环过程制备生物素标记的DNA样品目的断片。

1.2.3取变性后扩增产物1μl与9μl杂交液混合后滴于芯片阵列表面，盖上薄盖玻片，置于42℃预热的杂交盒中保温30min，使DNA样品与芯片上的特异性寡核苷酸探针结合。取出芯片，用洗液Ⅰ荡洗10min，用洗液Ⅱ平衡1min后，取15μl酶结合物溶液滴于芯片表面，室温30min，再用洗液Ⅱ荡洗1min后取100μl平衡液平衡芯片，再取一块1×1cm2的尼龙膜浸润显色液后小心盖于芯片表面，闭光室温静置45min，取下尼龙膜用去离子水洗后，高温烤干，用光学扫描仪记录尼龙膜结果。

1.2.4结果判断显色强度（计算机软件转换成荧光强度）大于阴性对照3倍为阳性。

1.2.5统计学结果数据表达采用均数±标准差，两样本均数比较采用t检验。

2结果

2.1生物素-亲和素系统用于HBVDNA多态性芯片检测信号结果

2.2用生物素-亲和素系统对HBVDNA多态性芯片显色检测临床乙型肝炎患者标本42例

2.342例HBVDNA多态性芯片检测结果，经计算机软件转换成荧光强度，其序列1896、1814、1762、1764及P区552位点的野生型结果分别为21000±7100、25900±9100、23700±8900、21000±7700、26000±8900，突变型结果分别为17200±6000、15700±6800、21500±8800、17600±5900、7000±3200、8300±3800（P区552野生型YMDD突变为YIDD、YVDD）。

2.4敏感度测定取10份HBVDNA模板混合用双蒸水进行倍比稀释后，取芯片1896位点野生型进行实验，结果模板稀释25时，结果为阴性，即敏感度为5.6×102病毒拷贝数/毫升。

2.5重复性测定取4份P区552YMDD阳性（强、弱各2份）血清，按强弱分别混合后用于芯片进行检测，重复测定20次并将结果全部转换成荧光强度，结果为35800±5400和18200±3600，批内变系数（CV）分别为15.1%和19.8%。

2.6特异性测定对照组41例及细菌2种无阳性出现，转换成荧光强度，结果为5300±1000。

3讨论

目前，基因芯片杂交结果的检测方法主要是荧光标记法，不同荧光分子具有不同波长，可用激光共聚焦扫描仪对不同波长的荧光同时进行扫描，而达到多样品同时检测，但是由于其信号读取设备价格昂贵，使得该技术难以推广应用，在我国也仅有少数科研机构和公司具有配备该设备的能力。而显色法采用传统的酶促反应，使杂交信号通过底物颜色呈现于芯片表面，并转印于尼龙膜，使杂交信号强度大大提高，该法快速、简便，不需特殊设备，易于推广应用。对HBVDNA变异的研究提示，一些基因位点的变异可能与临床及流行病有关。

HBV基因组的特殊结构使扩增全基因极为困难，我们应用两组引物双重PCR扩增HBV基因组P区与前C区，降低了对模板的要求，不需酶切即可用芯片一次检测到HBVDNA序列1896、1894、1762、1764、P区552等位点的野生株和突变株，从而为研究HBVP区和前C区基因结构与功能提供了新方法。表1显示42例HBV患者，HBVDNA序列的1896、1814、1762、1764、P区552位点突变率分别为40%、31%、50%、50%、10%。敏感度高达5.6×102病毒拷贝数/毫升。特异性高，非HBV标本及细菌均为阴性，本底强度为5300±1100，与各位点比较均有显著差异。重复性试验，高、低浓度CV值分别为15.1%和19.8%，此CV值略高，我们正进行减少本底、优化条件、标准化操作等方面的研究，使CV达到较理想的水平。总之，显色法用于芯片信号表达使基因芯片临床应用的成本大为减少，从而使推广（二级医院以上）应用成为可能。

注：基金项目：江苏省“333工程”基金项目（2002-29），盐城市社会发展计划项目（YZ200207）。

参考文献

[1]张冬雷，王惠民，施健等.DNA芯片检测乙型肝炎病毒基因多态性[J].中华微生物学和免疫学杂志，2004，24（1）：57.

[2]马达，王惠民，张芹等.地高辛标记引物酶显色法检测HBV基因多态性及应用[J].临床检验杂志，2004，22（6）：408.

[3]姜军平主编.实用PCR基因诊断技术[M].第一版.西安：兴界图书出版社，1996：22.