亚低温促进胶质瘤干细胞形成

亚低温促进胶质瘤干细胞形成

周金方贡伟一

江苏省昆山市第一人民医院神经外科江苏苏州215300

【摘要】目的：探讨亚低温对胶质瘤干细胞的作用。方法：U87和U251细胞培养48h后置入31度培养箱孵育，观察5d，计数干细胞克隆数目，CD133和NESTIN染色干细胞克隆，流式分析CD133阳性干细胞数。结果：在亚低温条件，5d后U87和U251细胞中干细胞克隆数目明显增加，前者平均每孔7个，后者平均每孔6个；CD133和NESTIN鉴定干细胞克隆染色阳性；流式分析分析U87细胞CD133阳性比例为30.1%，U251细胞CD133阳性比例为23.1%。结论：亚低温条件有利于促进胶质瘤干细胞形成。

胶质瘤是原发性脑肿瘤中最常见的恶性肿瘤。胶质瘤中存在一类具有干细胞特性的肿瘤细胞，被认为胶质瘤的起始、复发、恶性增殖和放化疗抵抗起着重要作用[1]。但关于胶质瘤干细胞的形成机制至今尚未完全理解。亚低温常被用于重症颅脑创伤患者的治疗[2]，但最近我们发现亚低温可以促进胶质瘤干细胞形成。

材料与方法

1．主要试剂

胎牛血清（FBS，美国Gibco公司），DMEM培养基（美国Gibco公司），干细胞培养基（SCM，美国Millipore公司），兔抗人CDl33、nestin抗体（英国Abcam公司），羊抗兔IgG二抗（美国SantaCruz公司）。

2.细胞培养

U87细胞和U251人胶质瘤细胞系购自上海中科院细胞库，培养于含10％FBS的DMEM培养基和置37℃、5％C02孵箱中培养48h后，将温度降低至31度，继续培养5天，期间更换含10％FBS的DMEM培养基两次。

3.计数干细胞克隆数目

细胞培养于24孔板中，每组6个复孔，5d后在100倍显微镜下计数干细胞克隆数目，然后取6孔平均值。

4．CD133和NESTIN免疫荧光鉴定

40g／L多聚甲醛固定30min，正常山羊血清封闭20min，CDl33和nestin一抗4℃孵育过夜，羊抗鼠IgG37℃孵育60min，每步骤间均用0.01mol／L的PBS漂洗3次，5min/次。甘油封固后置荧光显微镜下观察摄片。

5.流式分析CD133阳性干细胞数

加入1ulCD133抗体，4度避光孵育30min后行2000r/min离心5min，弃上清，BufferI液吹打混匀，再次离心、弃上清，BufferI液吹打混匀后流式细胞检测CD133的表达情况。

6．统计学方法所有实验结果采用SPSS11.0进行统计分析，采用方差分析，P<0.05差异有统计学意义。

结果

1.亚低温有效促进干细胞克隆形成

在31度亚低温的条件下，计数常温组和亚低温组发现培养五天后，常温组U87和U251细胞未形成1个干细胞克隆。而亚低温组U87和U251细胞分别形成平均每孔7个和每孔6个干细胞克隆。

2.CD133和NESTIN染色鉴定干细胞克隆

对31度亚低温的条件下诱导成功的U87和U251细胞克隆球进行CD133和NESTIN免疫荧光染色，提示成CD133和NESTIN双阳性（图1）。

3.流式分析分析CD133阳性比例

常温组培养5天后，流式分析U87和U251细胞中CD133阳性比例分别为1.3%和1.7%。亚低温组培养5天后，流式分析U87和U251细胞中CD133阳性比例分别为30.1%和23.1%。

讨论

胶质瘤干细胞的起源至今未明确。但胶质瘤干细胞主要表现出胶质瘤化疗耐药，被认为是肿瘤复发的根本原因。传统的实验观念认为胶质瘤干细胞的培养必需采用无血清培养法，在有血清的培养基中，干细胞会分化成成熟细胞[3]。但本实验中我们发现在亚低温的条件下可明显诱导完全培养基中胶质瘤干细胞克隆的形成，突破了无血清培养的限制。

神经干细胞标记物CD133和前体细胞标记物巢蛋白nestin被认为是目前诊断胶质瘤干细胞的最常用指标。CD133是相对分子质鼍为120000的跨膜蛋白，研究表明CD133阳性细胞例数在不同病理级别的脑胶质瘤组织中的表达存在相关性，即胶质瘤级别越高，CD133阳性细胞例数越多；不同病理级别的脑胶质瘤中CD133阳性细胞率与患者的复发率存在相关性，即不同病理级别的脑胶质瘤中，CD133阳性细胞率越高，患者复发率越高。而在胶质瘤干细胞和克隆球中也成阳性表达。巢蛋白相对分子质量为210000-240000，主要参与神经元和胶质细胞的分化，其是神经十细胞的特异性标记物，目前同样被证明是胶质瘤干细胞的一个重要诊断标志，在胶质瘤干细胞表面表达强阳性[4]。本实验通过CD133和NESTIN双染色证明亚低温诱导的克隆球是胶质瘤干细胞克隆球。

进一步，通过流式细胞仪分析显示亚低温组的CD133例远高于常温组，表明亚低温更能诱导胶质瘤的形成。而亚低温条件常被用于颅脑创伤的早期治疗，本实验从一个侧面提示胶质瘤患者不适宜采用亚低温治疗，因为其能诱导形成更多的胶质瘤干细胞。

参考文献：

[1]IwadateY.Epithelial-mesenchymaltransitioninglioblastomaprogression[J].OncolLett，2016；11（3）：1615-1620.

[2]LiYH，ZhangCL，ZhangXY，etal.Effectsofmildinducedhypothermiaonhippocampalconnexin43andglutamatetransporter1expressionfollowingtraumaticbraininjuryinrats[J].MolMedRep.2015；11（3）：1991-6.

[3]刘天助，宁瑜，廖红展.一种功能性分离和纯化胶质瘤干细胞的方法[J].中华神经医学杂志，2014，13（9）：865-869.

[4]HiraVV，PloegmakersKJ，GreversF，etal.CD133+andNestin+GliomaStem-LikeCellsResideAroundCD31+ArteriolesinNichesthatExpressSDF-1α，CXCR4，OsteopontinandCathepsinK[J].JHistochemCytochem，2015；63（7）：481-93.

[5]ChengSX，ZhangS，SunHT，TuY.EffectsofMildHypothermiaTreatmentonRatHippocampalβ-AmyloidExpressionFollowingTraumaticBrainInjury[J].TherHypothermiaTempManag，2013；3（3）：132-139.