几种微生物对千层塔生长及生物碱代谢作用的研究

几种微生物对千层塔生长及生物碱代谢作用的研究

周志涵

周志涵(湖南农业大学/湖南食品药品职业学院湖南长沙410014)

【摘要】目前国内在千层塔生物碱提取、应用等研究较多，但在诱导子方面的研究基本上处于空白。作为一种特定的化学信号，在植物与微生物的相互作用中，它们可以快速、专一和有选择地诱导植物代谢过程中特定基因的表达。本文在诱导子对千层塔生长及生物碱合成方面作了一些探讨。

【关键词】千层塔诱导子石杉碱甲石杉碱乙影响

【中图分类号】R318【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）11-0037-02

千层塔属于石杉科石杉属植物，全草常作为药物治疗跌打损伤、瘀血肿痛、精神分裂、肌肉痉挛、胆结石等疾病，其活性成分石杉碱甲和石杉碱乙具有很强的抑制胆碱酯酶活性、提高学习记忆力和改善老年人记忆功能的效果，对治疗重症肌无力、单纯记忆障碍和早老性痴呆有显著疗效。这些生物碱在野生千层塔植物体内的含量甚微，特别是在人工栽培千层塔植物体内并未发现石杉碱甲和石杉碱乙，人们企图采用化学合成和半合成的方法人工生产生物碱，但结果不尽人意。千层塔生长速度很慢，采用植物组织培养方法进行生产相关生物碱很难行得通。模拟野生栽培千层塔技术生产千层塔生物碱是一个极有潜力的途径，目前国内在千层塔生物碱提取、应用等研究较多，但在诱导子方面的研究基本上处于空白。近年来，采用植物体生产有用物质的研究中，利用诱导子处理植物体以促使细胞快速、大量合成有用次生物质已成为人们普遍重视的新方法。本文在诱导子对千层塔生长及生物碱合成方面作了一些探讨。

1材料与方法

1.1材料：千层塔H.serrata(Thunb.)Trev.全草采自湖南省永顺县。植株茎高10～24cm，多年生丛生，单一或数回二叉分支，匍匐或直立，茎生叶长1～2cm、宽2～4cm，孢子腋生，不定根生于匍匐茎。

1.2培养基:培养基为植物组织培养基(MS)、马铃薯葡萄糖培养基(PDA)、细菌培养基。

1.3内生菌的分离与纯化:按常规无菌操作，取新鲜野生的千层塔枝条叶（湖南省永顺县某地），按下列程序表面消毒：自来水冲洗→75％酒精漂洗(3—5min)→无菌水冲洗3—4次→0.1％升汞漂洗(15min)→无菌水冲洗5次。将上述处理过的千层塔叶在超净工作台下切至叶脉，切下的皮层再切成约0.5cm×0.5cm的小片，然后将小片接种于PDA或细菌培养基平板上，置28℃温箱培养，待切割的小片边缘有菌丝长出，经接种、纯化后转接到PDA或细菌培养斜面上备用。为了检查表面消毒是否彻底，将上述同样条件处理过的千层塔叶不作切割直接种植于PDA或细菌培养平皿上，置于相同的条件下培养，结果对照用的千层塔叶周围无任何菌长出，证明所分到的菌是韧皮部内的，而不是表面的附生菌。

1.4土壤中真菌和细菌的分离与纯化:取新鲜野生千层塔周围的土壤，加入无菌水混匀，稀释一定倍数后，接种于PDA和细菌培养基置28℃温箱培养，待菌落长出，经接种、纯化后转接到相对应的培养斜面上备用。

1.5菌种鉴定:真菌和细菌鉴定按常规方法进行。挑取纯化的菌株尖端菌丝或菌落分别接种于PDA或细菌培养基上。

1.6微生物对千层塔植株处理方法

采用相应液体微生物培养基，将分离得到的真菌和细菌进行扩大培养，得到发酵液备用。实验分为四组，第一组为对照组，第二组是采用内生菌发酵液处理千层塔植株，第三组是土壤微生物处理千层塔植株，第四组是所分离出微生物混合液处理千层塔植株。分别挑取人工栽培3年以上千层塔植株，每年5月份将发酵液稀释50倍后进行喷洒生长良好的千层塔植株，连续处理三年后取样进行检测。

1.7微生物发酵液与千层塔茎叶共培养

采用PDA液体培养基，将培养液分装在250mL的三角瓶中。植物材料采用人工栽培5年以上的千层塔，在栽培过程中并未喷洒微生物发酵液，将千层塔叶鲜茎叶剁碎。实验分为四组，第一组为PDA培养基，第二组是PDA培养基+千层塔叶鲜茎叶，第三组为细菌培养基，第四组是细菌培养基+千层塔鲜茎叶。分别挑取少许分离到的各种菌种接种于三角瓶中；同时把所有真菌一起接种到PDA培养基中，把所有细菌一起接种到细菌培养基中，置于摇床(100rpm)28℃黑暗培养7d，待微生物长好后进行提取。

1.8千层塔叶中石杉碱甲的HPLC检测

1.8.1千层塔叶样品处理

精密称取实验药材细粉2g于500ml的圆底烧瓶中，用95％的甲醇提取5次，合并滤液并回收溶剂，加入2％的酒石酸溶解，用氨水调节萃取液PH值至9.0，再用氯仿萃取三次，挥干有机溶剂，用无水乙醇溶解并定容至5ml即得。

1.8.2石杉碱甲和石杉碱乙检测条件

设备为Agilent1100高效液相色谱仪，色谱柱为HypersilODS(150mm×4.6mm，5μ)，检测条件∶流动相乙腈：磷酸盐缓冲液=14∶86，V/V)、检测波长为310nm、流速1mL/min、柱温30℃、进样量为20μL。

2结果与分析

2.1不同微生物对千层塔植株的影响

采用第4组方法进行处理，千层塔中有效生物碱的含量是最高的石杉碱甲含量(0.231‰)、石杉碱乙含量(0.086‰)，说明与千层塔接触的所有微生物对其有效生物碱的积累都是相关的；从影响大小来看，内生菌对其生物碱的积累比土壤微生物的影响要大得多，其有效生物碱含量达到了2倍以上。

2.2微生物发酵液对千层塔茎叶中相关生物碱的影响

采用第2组方法进行处理，千层塔中有效生物碱的含量是最高石杉碱甲含量(0.078‰)、石杉碱乙含量(0.043‰)，说明与千层塔接触的所有微生物中真菌对其有效生物碱的积累更为相关的，其有效生物碱含量比细菌处理的高出了近2倍；从影响效果来看，虽然真菌对其生物碱的积累比细菌的影响要大得多，但是没有细菌的作用对其有效生物碱含量下降达到了近3倍左右。

3讨论

生活在植物体内或在其生活史的一定阶段处于植物体内形成不明显侵染的一类真菌。自1993年发现从短叶红豆杉中分离出的内生真菌能够合成抗癌成分紫杉醇以来,人们希望通过内生真菌发酵合成药用成分,已有多种药用植物内生真菌分离及其药用活性成分鉴定与合成的报道,表明特定内生真菌可能在与宿主植物长期协同进化中由于遗传信息的传递获得了宿主植物的特定代谢途径,从而使内生真菌产生与宿主相同或相似的生理活性成分。分离内生真菌和宿主植物生长部位有关。内生真菌的菌丝通常生长于植物组织的细胞间,分布于叶鞘、种子、花、茎、叶片和根中。在千层塔中,内生真菌以茎中最多。在所分离的内生真菌中以丛梗孢目居优势类群,获得的内生真菌Ⅰ属顶孢霉属,没有孢子。

利用内生真菌生产药用活性成分才刚刚起步,许多基础性工作有待深入研究。红豆杉植物内生真菌生产紫杉醇能力从最初的纳克级水平到现在的微克级水平已经提高了3个数量级,据认为要商业化生产需达到毫克极水平,因此有若干关键问题需要解决。就千层塔内生真菌而言,应继续扩大内生真菌分离的数量和种类,并对分离的菌株能否合成石杉碱甲进行鉴定,以论证千层塔内生真菌发酵生产石杉碱甲的可行性。

参考资料

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