影响免疫组织化学染色质量的因素分析

影响免疫组织化学染色质量的因素分析

阮顺爱蔡爱英林秀香

福建省莆田市第一医院351100

摘要：目的探究影响免疫组织化学染色质量的因素并进行分析。方法从不同的方面对影响免疫组化学的染色质量的因素进行分析，分别包括组织固定、切片、烤片、抗原修复和免疫组化染色等五个方面，该研究主要对不同的固定剂对染色质量的对比进行详尽的分析，对其他的四个方面进行简明的比较和分析。结果Bouin液对SS和GAS的抗原性的保存较好，结果显示Bouin液保存的阳性细胞的平均数明显高于10%甲醛保存的阳性细胞数，两组比较有显著的差异，比较具有统计学的意义（P<0.05）；选择合格免疫组化试剂和染色方法，并设立实验对照样，采取严格实验操作，对该方法至关重要。结论选择合格和恰当的免疫组化试剂和合适的染色方法，并设立实验对照样，采取严格实验操作，才会得到合格的免疫组化的染色结果，才能是该方法更加可靠和精确。

关键词：免疫组织化；染色质量；因素分析

免疫组织花化学简称为免疫组化，是一种常用作的病理诊断的主要辅助手段，该技术是一种染色技术，受到越来越多的病理学的工作者的欢迎[1]。近年来，伴随着越来越多的新技术和新抗体的被发明，免疫组织化学的技术在病床病理的诊断中的应用更加的广泛，得到了很大程度上的推广。该方法为肿瘤性质的判断、临床病理的诊断以及预后的检测等都提供了非常重要的根据[2]。但是该方法还存在一些不稳定的因素，这些不稳定因素使得免疫组化的质量浮动比较大，是免疫组化工作者面临的主要问题。如何在实际的工作中消除和避免这些因素对免疫组化产生影响，已经成为了众多的工作者亟待解决的问题，该研究对免疫组化中对染色质量有影响的因素进行了分析并进行报道。

1不同的组织固定对免疫组化染色效果的影响

组织的固定是对免疫组化染色质量影响最为显著的因素。为了使得离体的组织的抗原性得到较好的保存，一般要求将离体的组织在15min之内将其固定好。

1.1方法

样本选取大鼠的胃窦组织，固定液分别选取Bouin液和10%的甲醛溶液，用图像分析技术和免疫组化方法对大鼠的胃黏膜的胃泌素和生长抑制素的表达进行检测，并对结果进行分析对比。

1.2不同的组织固定方法对免疫组化染色效果的对比与分析：Bouin液对SS和GAS的抗原性的保存较好，结果显示Bouin液保存的阳性细胞的平均数明显高于10%甲醛保存的阳性细胞数，两组比较有显著的差异，比较具有统计学的意义（P<0.05）；两种固定件的细胞的灰度数比较接近，比较没有显著的差异，不具有统计学的意义（P>0.05）；详见表1、2。

1.3统计学分析

资料、数据的整理与统计学分析分别选择EXEL软件和spss18.0进行，计量资料和计数资料的比较分析分别选择t检验和χ2检验，数据的表示方法以方便为准，P<0.05时，认为差异有统计学的意义。

2切片

在切片的过程中需要的是，应选择新刀片进行切片，避免组织过厚和刀痕，对于细胞比较密集的组织（淋巴结细胞）要求切片不要过厚（一般一4um为最佳）。为了避免组织的脱片或者是产生褶皱，要求脱片的最佳温度是43℃左右。此外，还需注意捞时，对含有气泡的组织切片应该刨除，以避免非特异性的着色出现。

3烤片

对以后可能会进行染色的切片应对其进行及时的烤片。烤片的最佳温度应该控制在59±1℃，烤片的时间应该大于半个小时[3]。烤片的过程要进行的充分且要注意烤片时的温度不要过高（温度过高切片极易氧化），以避免对切片抗原性造成破环或者是脱片。有关的研究表明，烤片的时间在2-4h的效果最佳。该研究表明最佳的烤片时间是2.5h。

4抗原的修复

抗原修复常用的方法有，高压锅加热法、胰蛋白酶消化法和微博加热法等，该研究表明，最佳的方法是高压锅加热法，加热的时间控制在3min左右，时间过长会使得染色的背景被加深。此外，还需注意，柠檬酸缓冲液不可以重复使用且必须保持切片完全浸泡到溶液之中。修复结束后应该是切片自行冷却。

5免疫组化染色

该过程选择Envision二步法进行，首先滴加一抗，应注意仔细，认真，不要加错或者是漏加，之后放置到湿盒内并于4℃的冰箱中过夜。其次，用PBS缓冲液冲洗至少3次，之后滴加二抗。

DBA显色液要求尽量使用最新配制的，滴加之前应该将切片充分洗涤。滴加的时候要注意，应该逐滴滴加，不可以此滴加过多，显色的时间一8min为最佳。整个过程要求设置对照样，以确保实验的可靠性。

6讨论

免疫组织化学要求组织细胞的尽量保持较好的形态和结构的完整性[4]。避免组织自溶，进而最大程度的对细胞和组织的抗原性进行保存，预防抗原的弥散，尽量减少非特异性着色的发生，使得阳性的结果比较清晰，较容易观察和辨认。

组织固定的目的在于近最大可能的保持组织和细胞的抗原性质，对免疫组化的着色成功与否至关重要[5]。选择不合适的固定剂或者是固定的操作不当，都会对结构的清晰度和抗原的显示产生不良的效果。进而对整个的着色产生影响。由此可见，最佳的固定剂和方法的选择与成功的组织着色有十分紧密的联系[6]。

经过以上的分析可知，众多的因素和环节都会对免疫组织着色质量的着色的质量产生影响。只有对这些因素和环节进行详尽的了解并对造成影响的因素进行逐一的分析，才能在最大程度上防止不良的因素对免疫组化产生影响，进而得到高质量的染色。该研究表明，Bouin液对SS和GAS的抗原性的保存较好，结果显示Bouin液保存的阳性细胞的平均数明显高于10%甲醛保存的阳性细胞数，两组比较有显著的差异，比较具有统计学的意义；两种固定件的细胞的灰度数比较接近，比较没有显著的差异。

综上所述，选择合格和恰当的免疫组化试剂和合适的染色方法，并设立实验对照样，采取严格实验操作，才会得到合格的免疫组化的染色结果，才能是该方法更加可靠和精确。

参考文献：

[1]马倩倩，孙敬锋，孙萌，张胜根，邢克智.半滑舌鳎脑组织中神经型一氧化氮合成酶免疫组织化学定位研究[J].水产科学，2013，32（10）：609-612.

[2]何新明，罗颖洁，杨通，莫明聪，林云恩，刘桂红.免疫组织化学染色技术常见问题的研究与探讨[J].中国免疫学杂志，2011，27（S1）：1188-1190+1194.

[3]周晓明，冯学威，赵立.胸腔积液脱落细胞免疫组织化学染色检测相关抗体对胸膜转移性肺腺癌和恶性胸膜间皮瘤的鉴别诊断价值[J].中国全科医学，2012，15（35）：4075-4078.

[4]白桂芹，李秋江，杜馨，张思航，郭洋，向宇，杨正伟，张小明，刘尚清.陈旧石蜡组织块的免疫组织化学染色及防脱片体会[J].重庆医学，2015，44（23）：3250-3252.

[5]鲁波，任丽芳，李美平，沈寅，张鹏，包磊.双拼对照法在免疫组织化学染色中应用[J].临床与实验病理学杂志，2014，30（03）：337-338.

[6]谢子平，谭艳，谢胜，王万荣，李韬，欧阳海，王澍弘，康照鹏.量子点荧光标记技术与免疫组织化学染色检测泌尿系统肿瘤组织特异性抗原表达的效果比较[J].广东医学，2014，35（15）：2372-2376.