调营饮对小鼠S180肝癌腹水模型腹膜淋巴孔密度及尿中钠Na+浓度的影响

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调营饮对小鼠S180肝癌腹水模型腹膜淋巴孔密度及尿中钠Na+浓度的影响

黄崇政唐成雷秋娥刘勇

永州市中医院湖南省永州市425000

【摘要】目的:探讨调营饮对小鼠S180肝癌腹水模型腹膜淋巴孔密度及尿中Na+浓度的影响。方法:取S180细胞接种于小鼠腹腔造成肝癌腹水模型,随机分为空白对照组(NS)、模型组(M)、调营饮组(T),造模后第五天用调营饮汤剂连续灌胃,观察对小鼠腹膜淋巴孔密度的影响及及尿中Na+浓度。结果:T组腹膜淋巴孔密度明显大于NS组和M组(P<0.01),T组尿Na+浓度明显大于NS组和M组,比较差异有显著性意义(P<0.05)。结论:调营饮对小鼠S180肝癌腹水模型有明显促进腹膜淋巴孔开放,分布密度增加,钠离子排出增多,可能是其消腹水作用机制之一。

【关键词】调营饮;S180;肝癌腹水;小鼠

Abstract:ObjectiveTostudyeffectofTIAOYINYINmixtureonconcentrationoftheperitoneallymphaticstomatainS180asciteslivercancermice,suchasdensityofdistribution.Methods:Thirty-twospecialpathogenfree(SPF)Kunmingmicewererandomizedinto3groups:blankcontralgroup(NS),modelcontralgroup(M),TIAOYINYINmixturemodelgroup(T),Makethemold5nddaystostartforthemedicine,after9ndmeasurethemice.Results:ComparedtoNSgroupandmodelgroup,TIAOYINYINmixturecouldsignificantlyenhancedensityofdistribution(P<0.05orP<0.01).Conclusion:TheseexperimentstudyshowedTIAOYINYINMixtureregulatingperitoneallymphaticstomata,improvingthedrainagefromperitonealcavityinthemalignantascites.

[KEYWORDS]TIAOYINYINMixture,S180livercancerascites,mice

原发性肝癌(Primaryhepaticcancer,PHC)为常见肿瘤,腹水(Ascites)是肝癌常见的并发症之一;肝癌腹水中医学称之为”鼓胀”,又称“水蛊”、“蛊胀”、“蜘蛛蛊”等,被历代医家列为四大难证之一[1,2]。调营饮是治疗肝癌腹水的常用方,疗效肯定,现通过动物实验研究,探讨调营饮可能的作用机理。

1.实验材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物:健康昆明种小鼠36只,SPF级,雄性,4-6同周龄小鼠,体重20-24g,由湖南中医学院实验动物中心提供。

1.1.2实验试剂和仪器:调营饮汤剂由永州市中医院药剂科提供;台盼蓝液的配制:取苔盼蓝0.049g溶于双蒸水1Oml,过滤分装储藏于室温备用;湖南师范大学JSM-6360LV型电子扫描显微镜。永州市中医院检验科半自动生化析仪。

1.1.3瘤株:小鼠S180肝癌株由上海中科院细胞库所保种瘤株。

1.2方法

1.2.1造模

取S180肝癌细胞株,接种于健康昆明小鼠腹腔,取腹腔传代第8日小鼠,选择腹水饱满小鼠,脱颈椎处死,固定于蜡板上,腹部皮肤用碘酒、酒精消毒后,在超净台内于无菌条件下消毒鼠腹,抽取乳白色腹水为瘤源,将获取的活体腹水细胞用生理盐水1:3稀释,小心摇匀,然后用苔盼蓝染色,显微镜下计数存活瘤细胞数,并调整浓度到每毫升含有106个瘤细胞,存活率95%。用75%的酒精消毒实验小鼠腹部后,将肿瘤细胞悬液以每只0.2ml分别接种到小鼠腹腔。全程严格无菌操作,40min内完成[3]。

1.2.2动物分组和给药:按照完全随机设计,遵照均衡性原则,先将小鼠按体重分层,然后查随机数字表将小鼠随机分成空白对照组(NS)、模型组(M)组、调营饮组(T),每组12只小鼠,用75%的酒精消毒实验小鼠腹部后,将肿瘤细胞悬液以每只0.2ml分别接种到除NS组的其它两组小鼠腹腔,造模后第5日,诊断性穿刺小鼠腹腔,如能抽取到腹水,证明造模成功。从造模后第5天开始NS组、M组以0.2mL/10g生理盐水灌胃,1次/d,连续5天,T组予成药0.03g/10g剂量灌胃[4,5,6],1次/d,连续5天;平均每只小鼠每天给等量鼠料4g/(只?d);一周换垫料2次,每日换新鲜水1次。

1.2.2观察指标及测定方法:

1.3.1尿Na+离子浓度测定

造模后第九天各组灌胃后,用自制代谢笼收集每组各小鼠2小时尿液,采用半自动生化析仪测定尿中Na+离子浓度。检测Na+采用6-氢氧化锑钾直接比浊法,原理如下:在分散剂和除干扰剂存在下,Na+与6-氢氧化锑钾在分散剂的作用下形成均一的浊度,在620nm波长下检测吸光度大小。简述操作程序如下:(1)分别向标准管、样品管加入试剂0.3ml(2)向标准管加入标准液20ul(3)向样品管加入样品20ul(4)分别向标准管、样品管加入促进剂200ul(5)形成混浊后各管加1ml乙醇稀释液,混匀后测定(6)半自动生化析仪用蒸馏水调零(7)620nm波长下检测吸光度,根据结果换算成Na+离子浓度。

做完尿液标本后拉颈处死小鼠,取小鼠右膈腹膜切成5mmx5mm,分别用2.5%戊二醛和1%娥酸双固定,2%单宁酸液导电处理,丙酮梯度脱水,醋酸异戊脂置换。HITACHC02临界点干燥仪处理,GTKOIB-5型离子溅射仪镀膜,JSM-6360LV扫描电镜观察,加速电压20kV,放大3500倍。数据测量用扫描电镜自带的smileview软件进行,在扫描电镜拍下的图片上测量淋巴孔密度(个/0.1mm2)[7]。

1.3.统计方法

应用SPSS15.0统计软件进行统计分析,实验数据用“”形式表示,结果之间多样本比较用F检验进行方差分析,组间均数两两比较用t检验,以P<0.05和P<0.01表示差异的显著性。

2.结果

2.1尿中Na+离子浓度

T组尿中平均Na+浓度明显高于NS组和M组,差异有显著性意义(P<0.01)。结果见表1。

注:与NS组比较*P<0.05,**P<0.01;与M组比较△P<0.05,△△P<0.01;

2.1各组腹膜淋巴孔分布密度情况

T组腹膜淋巴孔平均密度均明显大于NS组和M组,差异有显著性意义(P<0.01),结果见表2。

注:与NS组比较*P<0.05,**P<0.01;与M组比较△P<0.05,△△P<0.01。

图1调营饮组(T组)实验小鼠第九天

图2调营饮组(T组)腹膜淋巴ⅹ3500倍

讨论

在我国,临床上大部分原发性肝癌是与乙肝病毒感染有关,90%以上合并肝硬化,腹水为终末期肝癌的典型临床表现,对大多数患者而言,缓解腹水引起的症状是治疗的主要目标[8]。目前临床采取的治疗方法较多,疗效有限,各有优缺点。现在采用中西医结合治疗恶性腹水,不但改善症状显著还能延长生存期,且副作用小,显示出其优势,是今后一个发展方向[8]。腹膜淋巴孔是腹膜毛细淋巴管在腹膜间皮上的开口,有主动的物质吸收功能。腹膜腔-腹膜淋巴孔-腹膜下小管和淋巴引流单位-淋巴陷窝-腹膜淋巴管-脉管系是腹膜腔内物质转归的直捷通路,也是巨噬细胞进入腹膜腔执行免疫功能的重要途径,在腹水的转归方面意义重大。

中医方面肝癌腹水的发生与感受湿热邪毒或长期饮食不节、嗜酒过度、七情内伤等引起机体阴阳失衡有关,形成气滞、血瘀、水停腹中,肝气郁结,气滞血瘀,是形成鼓胀的基本条件,脾脏功能受损,运化失职,遂致水湿停聚;肾脏的气化功能障碍,不能蒸化水液而加重水湿停滞,是形成鼓胀的重要因素,病位涉及肝、脾、肾三脏。在病机上由于本病本虚标实,虚实挟杂,调营饮为临床常用方,治予活血化瘀、行气利水。方中当归、川芎、赤芍等以活血化瘀;莪术、延胡索、大黄以行气活血;瞿麦、槟榔、葶苈子、赤茯苓、桑白皮等以行气利尿;陈皮、大腹皮、白芷理气消胀;细辛、肉桂温阳利水;炙甘草、姜、枣调和诸药。共奏活血化瘀、行气利水之功。

本实验研究显示:调营饮T组尿中平均钠离子浓度明显高于NS组和M组。血浆渗透压是影响组织液回流的一个重要因素,提高血浆渗透压有益于腹水的消除,其中降低Na+摄入、促进尿Na+排出、调整离子渗透压是消除腹水的一个重要手段。结果显示本方能使小鼠S180肝癌腹水模型尿中钠离子排出增加,减轻水钠潴留,可能是其消腹水作用机制之一。调营饮对小鼠S180肝癌腹水模型有明显促进腹膜淋巴孔开放,分布密度增加,T组腹膜淋巴孔密度明显大于NS组和M组(P<0.01)。腹膜淋巴孔密度改变,尿离子浓度的影响,可能与调营饮消腹水作用密切的联系,调营饮通过促进调节性媒介物质的释放,引起腹膜淋巴孔开放,尿离子的排出增加,从而引起小鼠尿量有明显增加,消腹水利尿作用十分明显。调营饮中是什么成分促进调节性物质的释放;其具体的机制是什么,有那些媒介物质参与其中,我们将在以后的实验中继续探讨,为其临床应用提供理论基础。

参考文献:

[1]华海青.原发性肝癌病机特点探讨[J].中国中医基础医学杂志,2004,10(2):38-39

[2]周永兴.现代肝硬化诊断治疗学[M].人民军医出版社,2008,52(3):55-56

[3]盛庆寿.青蒿琥酯对S180肝癌小鼠的抑瘤作用及对肿瘤组织VEGF、FasL的影响[J].广州中医药大学学报,2008,36-39

[4]李仪奎.中药药理实验方法学第2版[M].上海科技出版社,1994,779-780

[5]陈谦,孙慧,李强等.医学实验肝癌动物模型的研究进展.中华实验外科杂志,2006:23(3):377-378.

[6]徐静,李旭.肝癌动物模型的建立[M].实用肝脏病杂志,2005;8(2):116-118

[7]李慧,李继承.腹膜淋巴孔研究的新进展[J].中国医学科学院学报,2007,22(6):585-586

[8]吴孟超.中医药在肝癌防治中的作用、地位和存在的问题.中西医结合学报[J],2003;1(3):163-164.

永州市中医院湖南省永州市425000

【摘要】目的:探讨调营饮对小鼠S180肝癌腹水模型腹膜淋巴孔密度及尿中Na+浓度的影响。方法:取S180细胞接种于小鼠腹腔造成肝癌腹水模型,随机分为空白对照组(NS)、模型组(M)、调营饮组(T),造模后第五天用调营饮汤剂连续灌胃,观察对小鼠腹膜淋巴孔密度的影响及及尿中Na+浓度。结果:T组腹膜淋巴孔密度明显大于NS组和M组(P<0.01),T组尿Na+浓度明显大于NS组和M组,比较差异有显著性意义(P<0.05)。结论:调营饮对小鼠S180肝癌腹水模型有明显促进腹膜淋巴孔开放,分布密度增加,钠离子排出增多,可能是其消腹水作用机制之一。

【关键词】调营饮;S180;肝癌腹水;小鼠

Abstract:ObjectiveTostudyeffectofTIAOYINYINmixtureonconcentrationoftheperitoneallymphaticstomatainS180asciteslivercancermice,suchasdensityofdistribution.Methods:Thirty-twospecialpathogenfree(SPF)Kunmingmicewererandomizedinto3groups:blankcontralgroup(NS),modelcontralgroup(M),TIAOYINYINmixturemodelgroup(T),Makethemold5nddaystostartforthemedicine,after9ndmeasurethemice.Results:ComparedtoNSgroupandmodelgroup,TIAOYINYINmixturecouldsignificantlyenhancedensityofdistribution(P<0.05orP<0.01).Conclusion:TheseexperimentstudyshowedTIAOYINYINMixtureregulatingperitoneallymphaticstomata,improvingthedrainagefromperitonealcavityinthemalignantascites.

[KEYWORDS]TIAOYINYINMixture,S180livercancerascites,mice

原发性肝癌(Primaryhepaticcancer,PHC)为常见肿瘤,腹水(Ascites)是肝癌常见的并发症之一;肝癌腹水中医学称之为”鼓胀”,又称“水蛊”、“蛊胀”、“蜘蛛蛊”等,被历代医家列为四大难证之一[1,2]。调营饮是治疗肝癌腹水的常用方,疗效肯定,现通过动物实验研究,探讨调营饮可能的作用机理。

1.实验材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物:健康昆明种小鼠36只,SPF级,雄性,4-6同周龄小鼠,体重20-24g,由湖南中医学院实验动物中心提供。

1.1.2实验试剂和仪器:调营饮汤剂由永州市中医院药剂科提供;台盼蓝液的配制:取苔盼蓝0.049g溶于双蒸水1Oml,过滤分装储藏于室温备用;湖南师范大学JSM-6360LV型电子扫描显微镜。永州市中医院检验科半自动生化析仪。

1.1.3瘤株:小鼠S180肝癌株由上海中科院细胞库所保种瘤株。

1.2方法

1.2.1造模

取S180肝癌细胞株,接种于健康昆明小鼠腹腔,取腹腔传代第8日小鼠,选择腹水饱满小鼠,脱颈椎处死,固定于蜡板上,腹部皮肤用碘酒、酒精消毒后,在超净台内于无菌条件下消毒鼠腹,抽取乳白色腹水为瘤源,将获取的活体腹水细胞用生理盐水1:3稀释,小心摇匀,然后用苔盼蓝染色,显微镜下计数存活瘤细胞数,并调整浓度到每毫升含有106个瘤细胞,存活率95%。用75%的酒精消毒实验小鼠腹部后,将肿瘤细胞悬液以每只0.2ml分别接种到小鼠腹腔。全程严格无菌操作,40min内完成[3]。

1.2.2动物分组和给药:按照完全随机设计,遵照均衡性原则,先将小鼠按体重分层,然后查随机数字表将小鼠随机分成空白对照组(NS)、模型组(M)组、调营饮组(T),每组12只小鼠,用75%的酒精消毒实验小鼠腹部后,将肿瘤细胞悬液以每只0.2ml分别接种到除NS组的其它两组小鼠腹腔,造模后第5日,诊断性穿刺小鼠腹腔,如能抽取到腹水,证明造模成功。从造模后第5天开始NS组、M组以0.2mL/10g生理盐水灌胃,1次/d,连续5天,T组予成药0.03g/10g剂量灌胃[4,5,6],1次/d,连续5天;平均每只小鼠每天给等量鼠料4g/(只?d);一周换垫料2次,每日换新鲜水1次。

1.2.2观察指标及测定方法:

1.3.1尿Na+离子浓度测定

造模后第九天各组灌胃后,用自制代谢笼收集每组各小鼠2小时尿液,采用半自动生化析仪测定尿中Na+离子浓度。检测Na+采用6-氢氧化锑钾直接比浊法,原理如下:在分散剂和除干扰剂存在下,Na+与6-氢氧化锑钾在分散剂的作用下形成均一的浊度,在620nm波长下检测吸光度大小。简述操作程序如下:(1)分别向标准管、样品管加入试剂0.3ml(2)向标准管加入标准液20ul(3)向样品管加入样品20ul(4)分别向标准管、样品管加入促进剂200ul(5)形成混浊后各管加1ml乙醇稀释液,混匀后测定(6)半自动生化析仪用蒸馏水调零(7)620nm波长下检测吸光度,根据结果换算成Na+离子浓度。

做完尿液标本后拉颈处死小鼠,取小鼠右膈腹膜切成5mmx5mm,分别用2.5%戊二醛和1%娥酸双固定,2%单宁酸液导电处理,丙酮梯度脱水,醋酸异戊脂置换。HITACHC02临界点干燥仪处理,GTKOIB-5型离子溅射仪镀膜,JSM-6360LV扫描电镜观察,加速电压20kV,放大3500倍。数据测量用扫描电镜自带的smileview软件进行,在扫描电镜拍下的图片上测量淋巴孔密度(个/0.1mm2)[7]。

1.3.统计方法

应用SPSS15.0统计软件进行统计分析,实验数据用“”形式表示,结果之间多样本比较用F检验进行方差分析,组间均数两两比较用t检验,以P<0.05和P<0.01表示差异的显著性。

2.结果

2.1尿中Na+离子浓度

T组尿中平均Na+浓度明显高于NS组和M组,差异有显著性意义(P<0.01)。结果见表1。

注:与NS组比较*P<0.05,**P<0.01;与M组比较△P<0.05,△△P<0.01;

2.1各组腹膜淋巴孔分布密度情况

T组腹膜淋巴孔平均密度均明显大于NS组和M组,差异有显著性意义(P<0.01),结果见表2。

注:与NS组比较*P<0.05,**P<0.01;与M组比较△P<0.05,△△P<0.01。

图1调营饮组(T组)实验小鼠第九天

图2调营饮组(T组)腹膜淋巴ⅹ3500倍

讨论

在我国,临床上大部分原发性肝癌是与乙肝病毒感染有关,90%以上合并肝硬化,腹水为终末期肝癌的典型临床表现,对大多数患者而言,缓解腹水引起的症状是治疗的主要目标[8]。目前临床采取的治疗方法较多,疗效有限,各有优缺点。现在采用中西医结合治疗恶性腹水,不但改善症状显著还能延长生存期,且副作用小,显示出其优势,是今后一个发展方向[8]。腹膜淋巴孔是腹膜毛细淋巴管在腹膜间皮上的开口,有主动的物质吸收功能。腹膜腔-腹膜淋巴孔-腹膜下小管和淋巴引流单位-淋巴陷窝-腹膜淋巴管-脉管系是腹膜腔内物质转归的直捷通路,也是巨噬细胞进入腹膜腔执行免疫功能的重要途径,在腹水的转归方面意义重大。

中医方面肝癌腹水的发生与感受湿热邪毒或长期饮食不节、嗜酒过度、七情内伤等引起机体阴阳失衡有关,形成气滞、血瘀、水停腹中,肝气郁结,气滞血瘀,是形成鼓胀的基本条件,脾脏功能受损,运化失职,遂致水湿停聚;肾脏的气化功能障碍,不能蒸化水液而加重水湿停滞,是形成鼓胀的重要因素,病位涉及肝、脾、肾三脏。在病机上由于本病本虚标实,虚实挟杂,调营饮为临床常用方,治予活血化瘀、行气利水。方中当归、川芎、赤芍等以活血化瘀;莪术、延胡索、大黄以行气活血;瞿麦、槟榔、葶苈子、赤茯苓、桑白皮等以行气利尿;陈皮、大腹皮、白芷理气消胀;细辛、肉桂温阳利水;炙甘草、姜、枣调和诸药。共奏活血化瘀、行气利水之功。

本实验研究显示:调营饮T组尿中平均钠离子浓度明显高于NS组和M组。血浆渗透压是影响组织液回流的一个重要因素,提高血浆渗透压有益于腹水的消除,其中降低Na+摄入、促进尿Na+排出、调整离子渗透压是消除腹水的一个重要手段。结果显示本方能使小鼠S180肝癌腹水模型尿中钠离子排出增加,减轻水钠潴留,可能是其消腹水作用机制之一。调营饮对小鼠S180肝癌腹水模型有明显促进腹膜淋巴孔开放,分布密度增加,T组腹膜淋巴孔密度明显大于NS组和M组(P<0.01)。腹膜淋巴孔密度改变,尿离子浓度的影响,可能与调营饮消腹水作用密切的联系,调营饮通过促进调节性媒介物质的释放,引起腹膜淋巴孔开放,尿离子的排出增加,从而引起小鼠尿量有明显增加,消腹水利尿作用十分明显。调营饮中是什么成分促进调节性物质的释放;其具体的机制是什么,有那些媒介物质参与其中,我们将在以后的实验中继续探讨,为其临床应用提供理论基础。

参考文献:

[1]华海青.原发性肝癌病机特点探讨[J].中国中医基础医学杂志,2004,10(2):38-39

[2]周永兴.现代肝硬化诊断治疗学[M].人民军医出版社,2008,52(3):55-56

[3]盛庆寿.青蒿琥酯对S180肝癌小鼠的抑瘤作用及对肿瘤组织VEGF、FasL的影响[J].广州中医药大学学报,2008,36-39

[4]李仪奎.中药药理实验方法学第2版[M].上海科技出版社,1994,779-780

[5]陈谦,孙慧,李强等.医学实验肝癌动物模型的研究进展.中华实验外科杂志,2006:23(3):377-378.

[6]徐静,李旭.肝癌动物模型的建立[M].实用肝脏病杂志,2005;8(2):116-118

[7]李慧,李继承.腹膜淋巴孔研究的新进展[J].中国医学科学院学报,2007,22(6):585-586

[8]吴孟超.中医药在肝癌防治中的作用、地位和存在的问题.中西医结合学报[J],2003;1(3):163-164.