反相高效液相色谱法检测血浆及肝脏组织中表阿霉素浓度

反相高效液相色谱法检测血浆及肝脏组织中表阿霉素浓度

陆炯炯

陆炯炯(第二军医大学附属东方肝胆外科医院特需治疗科200438)

【摘要】目的建立运用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定表阿霉素（Epirubicin，Epi）在大鼠血浆和肝脏组织中的浓度的方法。方法通过外周静脉注射表阿霉素后，取大鼠血浆及肝脏组织，经蛋白沉淀，有机相萃取，氮气吹干，流动相复溶等处理后，运用反相高效液相色谱法（RP-HPLC），检测表阿霉素的药物浓度，结果血浆中最小检测限为5ng/ml，在5～1000ng浓度范围内线性良好。肝脏中最小检测限为25ng/ml，在25～2000ng浓度范围内线性良好。结论建立了检测血浆、肝脏组织内表阿霉素（EPI）药物浓度的反相高效液相色谱荧光检测方法(RP-HPLC)。该方法具有灵敏度高、操作简单，稳定性好的特点。

【关键词】反相高效液相色谱法表阿霉素肝脏组织血浆

【中图分类号】R446.8【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）18-0043-02

近年来，针对肝脏肿瘤的局部区域性化疗方法发展很快，如肝动脉介入化疗，门静脉化疗等。表阿霉素是目前普遍使用的一种化疗药物。本研究旨在建立一种能够准确检测肝组织及血浆中表阿霉素浓度的方法。

1.材料与方法

1.1实验动物

健康成年SD大鼠30只,雌雄不拘，体重300～350g。主要试剂：表阿霉素（Epirubincin，EPI）标准品（≥98.5%，100mg，）中国药品生物制品检定所；柔红霉素（Daunorubicin，DAM,DNR）标准品，（≥91%，50mg）中国药品生物制品检定所。主要仪器：HP1100型高效液相色谱仪：美国惠普公司；HPLC色谱柱（C18，5μm，250×4.6mm）：美国DIKMA公司；岛津FR-10AXL荧光检测器：美国惠普公司；N2000色谱工作站：美国惠普公司。

1.2方法

1.2.1色谱条件

HPLC不锈钢色谱柱（C18，5μm，250×4.6mm）；流动相配置：超纯水：0.1mol/L磷酸：三乙胺：乙腈（70：3：0.07：27，v/v），水相与乙腈混和前用6MHCL调节PH值至2.8；流速设定为1.5ml/min柱温：25℃；荧光检测波长：激发光λex＝474nm；吸收光λem＝551nm；内标物质：柔红霉素（Daunorubicin，DAM）；标本进样量：50μl。

1.2.2标准品的准备

盐酸表阿霉素储备液的配置[1]：精密称取25mg盐酸表阿霉素，溶解于25ml甲醇配成1mg/ml的母液避光贮存于25ml容量瓶中备用。内标：柔红霉素贮备液的配置：精密称取25mg柔红霉素，溶解于25ml甲醇配成1mg/ml的母液避光贮存于25ml容量瓶中备用。

1.2.3标本的处理

经静脉注射表阿霉素，处死大鼠，于下腔静脉取血3ml，取肝脏组织约0.5g。全血标本经3500rpm离心后取得血浆，称取肝脏组织0.5g，储存在－70℃冰箱内保存。血浆标本的处理过程[2]：吸取500μl的待测血浆入15ml离心管，加入100μl的工作浓度的柔红霉素内标物质标准液，再加100μl0.2M氯化钙溶液，静置15分钟后，加入500μlPH=9.0的硼酸缓冲液混匀后，加入7ml提取液（氯仿：异丙醇，6：1v/v），在旋涡混匀器上剧烈振荡20分钟，以2800g离心5分钟，去除上层水相，加入200μl0.1M磷酸，在旋涡混匀器上混匀20分钟，以2800g离心5分钟，吸取上层水相50μl待测。肝组织标本的处理过程：称取0.5g肝组织,加入1ml生理盐水、100μl的工作浓度的柔红霉素标准液作为内标，匀浆5分钟，超声匀浆2min，加入7ml提取液（氯仿：异丙醇，6：1v/v）[3]，在旋涡混匀器上剧烈振荡20分钟，以2800g离心5分钟，上层水相去除后，避光用N2吹干，200μl流动相复溶，12000rpm/min离心5min，取上清50μl待测。

1.2.4标准曲线的绘制

将表阿霉素的标准品母液（1mg/ml），分别配成5，10，25，50，250，500，750，1000，2000μg/ml浓度的溶液。按照上述浓度分别加入空白血浆和肝脏组织中以柔红霉素为内标[4]，按照1.2.3的标本处理方法检测，将EPI峰面积与DNR的峰面积比值作为纵坐标，EPI浓度作为横坐标，用EXCEL软件绘制标准曲线。

2.结果

2.1色谱行为

按照前述的方法检测，可得到色谱分析图。在上述色谱条件下，表阿霉素的出峰时间约为4.8min，内标物质（柔红霉素）的出峰时间约为8.7min。

2.2标准曲线

根据色谱图象分析所得数据，以表阿霉素峰面积与柔红霉素峰面积比值（A）为纵坐标，浓度（C）为横坐标绘制标准曲线，血浆线性回归方程为：AEPI/ADAM=0.0183x+0.0988，相关系数R2=0.9962（n=12），本方法血浆最小检测浓度为5ng/ml，在5～1000ng浓度范围内线性良好。肝脏组织线性回归方程：AEPI/ADAM=0.0191x-0.8008，相关系数R2=0.998（n=12），本方法肝脏最小检测浓度为25ng/ml，在25～2000ng范围内线性良好。

图1：血浆中EPI浓度标准曲线

图2：肝脏中EPI浓度标准曲线

3.结论

建立了检测血浆、肝脏组织内表阿霉素药物浓度的反相高效液相色谱方法(RP-HPLC)。该方法具有灵敏度高、操作简单，稳定性好的特点。

4.讨论

表阿霉素属于蒽环类抗肿瘤药物[5]，临床上广泛应用于乳腺癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌等多种肿瘤的化疗治疗中[6]。因为表阿霉素的4’位羟基由顺位变成反位，其治疗效果与阿霉素相当，而心脏、骨髓毒性作用明显小于阿霉素[7]，所以表阿霉素目前已经广泛替代阿霉素[8]在临床上得到广泛使用。反相高效液相色谱方法(RP-HPLC)是常用检测药物浓度的方法，目前报道检测血浆，唾液等体液中表阿霉素的研究较多，没有专门针对组织中表阿霉素检测相关的研究。

本实验中，需要解决的主要问题是如何将表阿霉素从肝细胞中释放出来。组织匀浆预处理可以使肝细胞破裂，从而释放表阿霉素。氯仿-异丙醇有机溶剂为表阿霉素的良好提取剂，可以将表阿霉素从匀浆液萃取至有机溶剂中。经过氮气吹干，少量有机相复溶这两个步骤，可使检测样本的药物更加富集，从而提高最小检测限，提高检测精度。但匀浆处理并不能使所有细胞破裂，表阿霉素无法从肝细胞中完全释放，部分药物不能通过萃取过程转移至有机溶剂中，故造成肝脏中最小检测限比血浆中最小检测限高。

本方法通过匀浆-蛋白沉淀-萃取-有机相复溶等简单步骤，准确的检测出血浆和肝组织中的表阿霉素浓度。该方法学的建立为表阿霉素的药代动力学等相关研究奠定了基础。

参考文献

[1].BadeaI,LasarL,MojaBadeaI,LazarL,MojaD,etal.AHPLCmethodforthesimultaneousdeterminationofsevenanthracyclines.JPharmBiomedAnal.2005,39(1-2):305-9.

[2].DoddeWI,MaringJG,HendriksG,etal.DeterminationofepirubicinanditsmetaboliteepirubicinolinsalivaandplasmabyHPLC.TherDrugMonit.2003,25(4):433-40

[3].CusackBJ,YoungSP,DriskellJ,etal.Doxorubicinanddoxorubicinolpharmacokineticsandtissueconcentrationsfollowingbolusinjectionandcontinuousinfusionofdoxorubicinintherabbit.CancerChemotherPharmacol.1993,32(1):53-8.

[4].GrossePY,BressolleF,RouanetP,etal.Methyl-beta-cyclodextrinanddoxorubicinpharmacokineticsandtissueconcentrationsfollowingbolusinjectionofthesedrugsaloneortogetherintherabbit.IntJPharm.1999,180(2):215-23.

[5].HortobagyiGN.Anthracyclinesinthetreatmentofcancer.Anoverview.Drugs.1997,54Suppl4:1-7.

[6].WeissRB.Theanthracyclines:willweeverfindabetterdoxorubicin?SeminOncol.1992,19(6):670-86.

[7].PloskerGL,FauldsD.Epirubicin.Areviewofitspharmacodynamicandpharmacokineticproperties,andtherapeuticuseincancerchemotherapy.Drugs.1993,45(5):788-856.

[8].DelemasureS,VergelyC,ZellerM,etal.[Preventingthecardiotoxiceffectsofanthracyclins.Frombasicconceptstoclinicaldata].AnnCardiolAngeiol.2006,55(2):104-12.