微囊胰岛移植体的相关问题和进展

【关键词】 微囊胰岛移植体

　　异种胰岛移植可能是治疗1型糖尿病最有希望的方法 ,它不仅能逆转糖尿病动物和人的高血糖状态,而且能防止糖尿病慢性并发症的发生及发展［1］。然而,排斥反应和生物安全性一直是阻碍异种移植的两个主要问题［2～3］。微囊移植技术能起有效的免疫隔离作用，为解决排斥反应、供体缺乏等问题提供了新思路［4］,但是目前微囊化移植体均未能有效地摆脱有限的功能和寿命［5］。猪的内源性逆转录病毒（ porcineendogenous ret rovirus, PERV ）可感染体外培养人细胞 ,这使跨种族间感染已引起人们的重视［6］。作者就这些方面来阐述微囊异种胰岛移植体的相关问题研究进展情况。

　　1 有关微囊移植体的现存问题和前景

　　1.1 微囊移植体免疫原性 　

　　微囊免疫隔离的局限性主要表现在不能完全隔离囊内异种细胞产生的小分子物质的渗出, 激活局部免疫细胞、诱导纤维细胞浸润, 引起排斥反应及移植部位纤维化; 又不能完全隔离移植体外免疫细胞分泌的NO、过氧化物、自由基、部分细胞因子等的直接渗入, 影响囊内细胞功能。有研究者采用海藻酸-钡交联微囊包裹新生猪胰岛样细胞簇，对取出的微囊进行免疫染色，发现囊周及囊内皆有荧光反应存在，表明抗体可通过囊壁［7］，而细胞因子较抗体的分子量小得多，可推断细胞因子也能通过。Salfey［8］等采用微囊化移植联合CTLA4-Ig 处理,可有效延长微囊化胰岛的功能和寿命。另一些研究显示虽然微囊具有免疫隔离作用, 但是这并不能阻止移植体产生的小分子抗原的渗漏, 从而激活受体对移植体的免疫应答，而且排异反应跟供受体之间种属差异程度密切相关, 种属差异越大, 则该排异反应越严重［9］。 巨噬细胞也是影响囊内细胞存活的主要免疫细胞 ,其分泌的小分子致炎因子NO等对囊内移植物有免疫排斥作用。有研究将脂氧化酶抑制剂去甲二氢愈创木酸(Nor-dihydroguaiaretic acid NDGA）与移植体共包囊,可有效抑制巨噬细胞活性和趋化作用,并延长移植体寿命［10］。许多动物实验已证实微囊胰岛的免疫隔离效果,明显延长了移植物的存活时间;但是也应该注意到免疫隔离后的胰岛，无直接的血液供应，氧等营养物质只能靠弥散作用才能获得 ,这必然导致胰岛尤其是中心区胰岛氧气等营养物质供应不足而丧失功能。虽然目前微囊化胰岛还存在较多不足,但随着微囊技术的不断优化、制作微囊材料的进一步完善及对胰岛分离、纯化、移植技术的日渐改进,胰岛移植终将造福于人类糖尿病,微囊移植体可能就是关键技术。

　　1.2 微囊移植体的移植环境

　　由于微囊的隔离作用, 移植体不能建立直接的血管通路, 其营养物质和供氧，只能通过渗透的方式从周围组织获得。微胶囊周围的新生血管不但对胰岛的生存至关重要 ,而且提供适宜的葡萄糖胰岛素动力学 ,使胰岛移植物发挥最佳效果.因而选择合适的移植体环境对微囊化移植体的功能发挥和存活至关重要。理想的移植体环境应该满足下面三个条件:( 1 )移植部位氧分压高;(2) 周围血管化程度高; (3) 相对免疫特惠, 但是上述条件很难同时满足。按移植部位也可将胰岛移植分为原位移植和异位移植：所谓原位移植是基于胰岛素经门静脉进入肝脏代谢这一生理基础来确定的, 包括门静脉内、肝内、脾内、大网膜及腹腔内等部位的移植；异位移植则指皮下、肌肉内、睾丸内、胸腔内、肾包膜下及脑内等部位的移植。Robitaille［11］等将鼠胰岛微囊在含胰岛素样生长因子（ILGF-Ⅱ）的培养液中培养后，通过组织学、荧光显微镜观察及凋亡研究表明， ILGF-Ⅱ呈剂量依赖性提高胰岛活性，减少凋亡率及坏死率。因为ILGF-Ⅱ是胰管细胞分泌的最丰富的生长因子，相当于部分重建了胰岛在胰腺中的微环境，移植时建立部分或全部同体内相同的微环境有利于移植物长期存活，从而提高移植效果。在对微囊化胰岛的研究中,努力解决把微囊胰岛移植于何处会产生最佳效果的问题,通过对血管腔内移植、血管腔外移植的尝试,发现血管内移植血液似乎成为容纳胰岛的免疫特惠区,移植物未被排斥,形态结构完整,细胞功能活跃,而且移植物释放的胰岛素直接进入血液符合胰岛素的生理释放特点,但其并发症如血栓形成和移植后感染情况较严重,总的说来血管内移植弊多利少［12］。

　　2 微囊移植体细胞供源的问题和进展

　　2.1 胰岛细胞来源 　　

　　基础研究和临床实践的证据均显示，在糖尿病的自然病程中，胰岛β细胞功能的持续恶化是一个不可逆的过程。目前胰岛移植仍然面临着胰岛组织来源不足和免疫排斥反应的问题，尤其是供体来源不足限制了胰岛移植的广泛开展。最新研究应用干细胞移植技术来解决胰岛β细胞来源，就是通过一定的技术和方法使干细胞定向分化成为能够制造胰岛素的β细胞，然后移植到糖尿病患者体内以提供胰岛素。胚胎干细胞 （embryonic stem cell ,ES）将从胚胎中获得的多能干细胞 ,通过特殊物质诱导或使其高表达某些特定因子,从而使其分化成具有某些胰岛细胞特性的细胞。这些在实验室中产生的细胞具有许多胰岛细胞的特征 ,包括胰岛素的产生和释放 ,但是目前这些细胞不具有根据机体葡萄糖水平调控胰岛素分泌的能力［13］,因此离广泛临床应用还有一定的距离。骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells BMMSCS)取材方便, 容易进行体外分离、培养和纯化, 且具有跨越分化潜能,可望解决细胞来源和免疫排异问题。 Kodama等［14］ 将骨髓干细胞移植入糖尿病前期的小鼠和已患糖尿病的小鼠, 能阻止糖尿病前期的小鼠进展致糖尿病, 将胰岛移植在已做骨髓移植的糖尿病小鼠的肾包膜下,在血糖恢复至正常后, 切除移植的胰岛, 这些糖尿病小鼠的血糖仍然保持正常。人胰腺导管细胞也已被成功分离并诱导分化为胰岛细胞，但尚未证实其是否有降低血糖水平的功能。根据目前所得的众多实验结果 ,经诱导分化所得到的胰岛样细胞 ,其胰岛素分泌量远小于正常胰岛细胞的胰岛素分泌量。当然，要推广干细胞应用还存在着一系列的问题：(1)如何保持移植干细胞分化和增殖的平衡性，使增殖后的细胞能够有效地分泌胰岛素，而有效产生胰岛素的细胞又能很好地增殖；(2)移植干细胞的安全性如何，有无 诱发肿瘤的可能；(3)异体干细胞移植物如何逃避自身免疫，目前微囊化技术能否最终解决这一难题?胰岛组织来源不足和免疫排斥反应是胰岛β细胞移植面临的两大难题，现在认为解决这两大难题最有希望的途径是治疗性克隆。除了改进胰岛β细胞移植技术外，寻找患者体内的胰岛β细胞替代细胞也是当今的研究热点，即通过胰岛素基因治疗使替代细胞产生胰岛素，以便弥补胰岛素分泌的不足，也可避免了针对胰岛细胞的免疫损伤［15］。目前人工构建的类胰岛细胞主要面临的问题是如何使转染的靶细胞产生葡萄糖依赖的胰岛素释放反应［16］。因此,如何选择适当靶细胞、载体及调控因子至关重要。2.2 异种细胞来源的风险性分析 　　

　　目前认为 ,猪是最可能用于临床胰岛移植的供体来源,因为:(1)猪胰岛是一种不受限制的组织来源;(2)猪胰岛素仅有一个氨基酸与人体来源不同;(3)猪胰岛素临床应用于治疗糖尿病患者已达数10年;(4)猪体内糖代谢调节与人类相似。然而2000年Luc［17］等证实,PERV 可感染接受猪胰岛移植的严重联合免疫缺陷小鼠,跨种间感染及异种移植的安全性受到重视。实际上猪可在绝对无菌的环境中养殖，这样猪的胰岛细胞移植要比人胰岛细胞移植相对安全，但猪的PERV是不得不考虑的病毒；PERV是嵌合在猪的基因上的一种病毒，可随猪的繁殖而传代，而野生型猪携带PERV，并可在体外感染人的细胞，同时由于其在猪基因上的强复制性，以及不可感知的前病毒的强互补性，而且很难做出敲除PERV基因的猪，因此分布于猪基因组内的PERV序列是制约猪作为异种器官移植供体的主要因素。尽管在接受猪源器官或组织细胞移植的人体内,尚未发现 PERV 感染的证据,生物安全性一直是阻碍猪细胞/器官异种移植的一个主要因素［18］ 。由于免疫排斥等原因，PERV转移到人体的可能性几乎为零,当然最为安全的办法是找出或做出PERV阴性猪。采用微囊化新生猪胰岛细胞移植到大型实验动物—狗的肝脏中,发现移植后微囊化新生猪胰岛细胞能够在受体中存活 ,发挥生物学效应,未发现 PERV发生跨种系感染 ,海藻酸钠微囊可防止猪 PERV 的穿越 ,可能在异种移植中具有较好的应用前景［19］。因为猪可在绝对无菌的环境下养殖，进行各种包括基因转移，敲除等的处理，同时可无限制的进行绝对大量的临床前期试验，因此相比同种胰岛移植更为安全，更具临床可行性的异种胰岛移植应该是可实现的。

【参考文献】
　　1 Fiorina P, Secchi A. Pancreatic islet cell transplant for treatment of diabetes. Endo-crinol Metab Clin North Am，2007，36(4):999～1013.

　　2 Toledo-Pereyra L H, Lopez-Neblina F. Xenotransplantion: a view to the past and an unrealized promise to the future .Exp Clin Transplant, 2003,11:127.

　　3 Tseng Y L, Sachs D H, Cooper D K. Porcine hematopoietic progenitor cell transplantion in nonhuman primates: a review of progress . Transplantion, 2005, 79（1）: 1～9.

　　4 Calafiore R, Basta G, Luca G， et al. Standard technical procedures for microencap- sulation of human islets for graft into nonimmunosuppressed patients with type 1 diabetes mellitus . Transplant Proc，2006，38(4):1156～1157.

　　5 De Vos P， De Haan BJ，De Haan A，et al. Factors influencing functional survival of microencapsulated islet grafts，Cell,2004，13 (5) ∶515.

　　6 Tacke S J, Kurth R, Denner J. Porcine endogenous retrovir uses inhibit human im-mune cell function : risk for xenotransplantation? Virology, 2000, 268 （1） : 87～93.

　　7 Omer A, Duvivier-Kali VF, Trivedi N, et al. Survival and maturation of microen-capsulated porcine neonatal cell clusters transplanted into immunocompetent mice. Diabetes,2003,52:69～75.

　　8 Salfey SA, Kapp JA,Weber CJ. Proliferative and cytokine responses in CTLA4-Ig- treated diabetic NOD mice transplanted with microencapsulated neonatal porcine. ICCs Cell Trans plant,2002，11（7）∶695.

　　9 Jones KS, Sefton MV , Gorczynski RM . In vivo recognition by the host adaptive immune system of microencapsulated xeno.geneic cells. Transplantation, 2004，78(10) ∶1454.

　　10 De Vos P ，De Haan B J，De Haan A ，et al. Factors influencing functional survi-val of microencapsulated isletgrafts Cell. Transplant,2004,13 (5) :515.

　　11 Robitaille R,Dusseault J,Henley N,et al. Insulin-like growth factor Ⅱ allows prolonged blood glucose normalization with a reduced islet cell mass transplantation . Endocrinology,2003,144:3037～3045.

　　12 Emamaullee JA, Stanton L, Schur C, et al. Caspase inhibitor therapy enhances mar-ginal mass islet graft survival and preserves long-term function in islet transplanta-tion. Diabetes， 2007，56(5):1289～1298.

　　13 Huotari MA , Miettinen PJ , Palgi J, et al. ErbB signaling regulates lineage determi-nation of developing pancreatic islet cells in embryonic organ culture. Endocrin-ology, 2002 , 143(11) : 4437.

　　14 Kodama S ，KuhtreiberW， Fujimura S, et al . Islet regeneration during reversal of autoimmune diabetes in NOD mice . Science，2003,5648:1223～1226.

　　15 Lin HT, Kao CL, Lee KH, et al . Enhancement of insulin-producing cell differentia-tion from embryonic stem cells using pax4-nucleofection method.World J Gastroentero,2007，13(11):1672～1679.

　　16 Ikonomou L, Geras-Raaka E, Raaka BM, et al. Beta-catenin signalling in mesenchy-mal islet-derived precursor cells. Cell Prolif， 2008 ，41(3):474～491.

　　17 Luc J W , Vander L, Christopher L, et al. Infection by porcine endogenous retrovirusafter islet xenotransplantantion in SCID mice. Nature, 2000, 6800 : 90～94.

　　18 Boneva RS, Folks TM. Xenotransplantion and risks of zoonotic infections . Ann Med, 2004, 36(7): 504～517.

　　19 叶征 ,邢晓为 ,童琼娟 ,等. 异种移植微囊化新生猪胰岛细胞受体感染 PERV潜在风险分析. 中南大学学报( 医学版) ,2007,32（5）：747～752.